Използване на протокол Tomoauto за високопроизводителен автоматизиран протокол за криоелектронна томография

Обобщение

Представяме протокол за това как да използваме крио-електронна томография с висока производителност за определяне на in situ структури на молекулярни машини. Протоколът позволява обработка на големи количества данни, избягва често срещаните тесни места и намалява недостъпността на ресурси, позволявайки на потребителя да се съсредоточи върху важни биологични проблеми.

Въведение

Системите за секреция от III тип (T3SS) са основни детерминанти на вирулентността за много Грам-отрицателни патогени. Инжектизомата, известна също като игления комплекс, е централната машина на SST3, необходима за директната транслокация на ефекторни протеини от бактериите в еукариотни клетки гостоприемници 1, 2. Инжектизомата се състои от извънклетъчна игла, основно тяло и цитоплазмен комплекс известен също като три комплекс 3. Предишни проучвания са изяснили триизмерните структури на пречистените инжекциози на Salmonella и Shigella, както и атомните структури на основните протеини на базалното тяло 4, 5. Последни in situ структури на инжекциите на Salmonella, Shigella, и Yersinia са разкрити от cryo-ET 6, 7. Въпреки това, цитоплазматичният комплекс, който е от съществено значение за селектор на ефектор и игла, не е визуализиран в тези структури.

Този високопроизводителен крио-ЕТ тръбопровод е използван за визуализиране на непокътнати инжекционни зони в минилетки S. flexneri. Общо 1 917 томограми са генерирани по този метод, разкривайки висока разделителна способност на непокътнатата машина in situ структура, включително платформата за сортиране на цитоплазмата, определена от средната подтомограма от 19. С молекулярното моделиране на дивия тип и мутантни машини, нашите високо- пропускателната тръба предлага нов път за разбиране на структурата и функцията на непокътнатия инжектируем в естествения клетъчен контекст.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Подготовка на миницел

2. Подготовка на EM мрежа

3. Автоматизирана колекция с висока поток накланяща серия

  1. Колекция от планове за ниско увеличение
    1. Отворете нов прозорец на Navigator, като щракнете върху "Open" в менюто "Navigator" на SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
    2. Намерете решетъчни клетки, които съдържат приемливи условия за изобразяване (например тънък лед, без замърсяване, обект на интерес), като използвате флуоресцентния екран с ниско увеличение (

    4. Високоскоростна автоматизирана обработка и реконструкция на накланяне с помощта на Tomoauto

    5. Средна субтомограма

    ЗАБЕЛЕЖКА: Използваме пакета i3 от 15 (http://www.electrontomography.org/) за обработка на експериментите със средна субтомография, но описаният протокол обикновено се прилага за повечето налични експерименти за субтомографски процес под субтомография Средно софтуер package16to, но описаният протокол се прилага като цяло достъпен за повечето софтуерни подтомограми за усредняване на 16-18.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Мини-клетъчни проби от S. flexneri бяха събрани и обработени, както е показано сигурен схематичната фигура 1, използвайки следния подробен tomoauto тръбопровод сигурен фигурата 2. Сериите за накланяне бяха събрани с помощта на SerialEM 10, който позволява високопроизводително накланяне-сериен запис в определени от потребителя точки на щрангове с ниско увеличение. (фигура 3). Микрографиите бяха събрани, като се използва режим на фракциониране на дозата върху камера с директно зондиране, за да се намали индуцираното от лъча движение 22 (Фигура 4). Tomoauto координира корекцията на движението, като прави колекция от микроскопични снимки на разделени дози от лечението, всяка с MOTIONCORR 22 и събира резултатите в сериен наклон, който да бъде обработен по-късно (Филм 1).

    tomoauto
    Фигура 1. Схематичен преглед на високопроизводителната крио-електронна томография. Течна суспензия бързо се замразява върху ЕМ мрежа и набор от накланящи се серии се събира от автоматизиран компютърно управляван електронен микроскоп. Получените микрографии се обработват автоматично с помощта на томоавто за генериране на томографията. Последната стъпка тук е сегментирана минилетка на S. flexneri от томография, генерирана от този протокол от Hu et al. 2,015 15. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


    Фигура 2. Схема на процеса на томоавто. Разбивка на томоавтото показва как се обработват данните от колекция от микроскопични снимки с разделени дози чак до окончателна средна субтомография. Подпроцесните символи подробно описват задачите, които томоавто координира за обработка на въвеждането чрез стартиране на съответния конфигуриран софтуер. Символите на изходните данни обикновено показват, че не се използват от потребителя, докато документите и многосимволните документи показват изхода, действително манипулиран от потребителя. Накрая символите на дисплея показват къде се случва намесата на потребителя в работния процес. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.