Измервания на физиологичните реакции на стрес в C

Обобщение

Тук ние характеризираме клетъчните протеотоксични стресови реакции в нематода C. elegans чрез измерване на активирането на флуоресцентни транскрипционни репортери и наблюдение на чувствителността към физиологичен стрес.

Резюме

Въведение

Много знания за регулацията и активността на клетъчните стресови реакции са приписани на нематода Caenorhabditis elegans, многоклетъчен моделен организъм в генетичните изследвания. Нематодите дават възможност да се изследва не само активирането на стресовите реакции на клетъчно ниво, но и на нивото на организма; Нематодите са използвани за изследване на ефектите от генетични нарушения или излагане на лекарства и замърсители върху техния растеж и оцеляване. Бързото им време за генериране, изогения, прозрачност, способността за генетично сцепление и лекотата на използване по време на експерименти ги правят идеални за такива изследвания. В допълнение, относително бързата физиологична реакция на стрес (между часове и няколко дни) и еволюционното запазване на клетъчните пътища правят нематодите отличен инструмент в изследването на устойчивостта на стрес.

В допълнение към репортерския анализ, чувствителността или устойчивостта на животните към стрес могат да бъдат измерени с физиологични стрес тестове. Това се постига чрез излагане на животните на стресова среда, която активира определени клетъчни стресови пътища. Тук се предлагат различни методи за измерване на чувствителността на цели животни към определени видове стресови фактори.

ER стресът се прилага върху C. elegans с помощта на химическия агент туникамицин, който блокира N-свързаното гликозилиране и причинява натрупване на неправилно сгънати протеини в ER 10. При C. elegans растежът води до значителни нарушения в функцията на ER и значително намалена продължителност на живота при излагане на туникамицин 11. Чрез измерване на оцеляването на животните върху плочи, съдържащи туникамицин, може да се определи количествено чувствителността на ER към стреса. Например, животните с ектопична индукция на UPR-ER и по този начин повишена устойчивост на стрес при неправилно сгъване на протеини в ER имат повишена преживяемост след излагане на туникамицин в сравнение с дивите животни 12. ТОЙ

Окислителният и митохондриалният стрес се прилага върху C. elegans чрез излагане на животните на химичния агент паракват. Паракват е често използван хербицид, който причинява образуването на супероксид, особено в митохондриите 13. Поради специфичната локализация на получените от митохондриите реактивни кислородни видове (ROS), паракватните тестове често се използват като "митохондриален" стрес тест. Супероксидът обаче бързо се превръща във водороден пероксид чрез митохондриални супероксидни дисмутази (СОД) 14. Тогава водородният пероксид може да дифундира от митохондриите и да причини оксидативен стрес в други части на клетката. Следователно ние описваме тестовете за оцеляване на паракват като мярка за чувствителност както към митохондриален, така и към оксидативен стрес (други анализи за оксидативен стрес вж. 15).

Тестовете за термична съвместимост се провеждат при C. elegans чрез поставяне на животни при повишени температури. Температурата на околната среда за нематоди е 15-20 ° C, а топлинният стрес се предизвиква при температури над 25 ° C 16, 17. Тестовете за термична съвместимост обикновено се провеждат при температури от 30-37 ° C, тъй като животните имат големи клетъчни дефекти при тази температура и тестовете за оцеляване се завършват в рамките на 24 часа 16, 18. Тук се разглеждат два алтернативни метода при извършване на тестове за термотолерантност: растеж при 34 ° C и растеж при 37 ° C. Заедно представените тук протоколи могат да се използват за извършване на мащабни екрани, когато се комбинират със стандартен нокдаун на ген с РНК интерференция или библиотеки с химически лекарства.

Протоколът може да бъде разделен на 4 общи процедури - растеж на C. elegans и подготовка за изобразяване (раздели 1 и 2), изображения на транскрипционни репортери с помощта на флуоресцентна микроскопия (раздели 3-5), количествени измервания на репортери, използващи голям поток от частици - Цитометър (раздел 6) и физиологични игли за измерване на чувствителността към стрес при C. elegans (раздел 7).

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Стандартни условия на отглеждане на температури & OP50 срещу HT115

2. Инсцениране/синхронизиране на червеи чрез избелване

5. Изображения със стерео микроскоп или микроскоп с широко поле/състав с ниско увеличение

6. Количествени измервания от репортери с голям цитометър за поток на частици

ЗАБЕЛЕЖКА: Растежът и подготовката на червеи за анализ на цитометър с пълна дължина с големи частици може да следва същите парадигми като раздели 1-5 за подготовка на червеи за флуоресцентно изобразяване, с изключение на това, че се изисква по-голям брой животни . Използвайте> 500 животни за условие, тъй като някои животни ще бъдат загубени по време на манипулация, не всички животни отговарят на критериите за филтриране по време на количественото определяне, а някои животни няма да бъдат разчетени правилно от поточния цитометър. Измийте животните за сортиране на плочи в 5-10 ml разтвор на M9 в конични епруветки от 15 ml за последващо сортиране на поточния цитометър.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Използване на транскрипционни репортери за измерване на активирането на стресовите реакции
Тук се използват флуоресцентни транскрипционни репортери, които служат като стабилни инструменти за измерване на активирането на повечето реакции на стрес при C. elegans. Експресията на GFP се задвижва, под подкрепата на канонични цели, от главните регулатори на транскрипцията, участващи в реакция на специфични за темата стресове. За изчерпателен списък на често използваните репортери за транскрипция вижте Таблица 3.

Физиологични тестове за измерване на податливостта на стрес при C. elegans
C. elegans са чудесен модел модел за измерване на чувствителност към стрес поради ниските разходи за поддръжка и експерименти и лекотата на редактиране на генома или генетичен нокдаун с RNAi, което предлага способността да се провеждат мащабни експерименти в цял организъм. За да анализираме толерантността към стрес към ER стрес, ние изложихме C. elegans на химикала туникамицин, който причинява натрупването на увредени протеини в ER чрез блокиране на N-свързано гликозилиране 10. Животните са изложени на туникамицин след развитието, тъй като лекарството причинява дефекти в развитието. Когато са изложени на туникамицин, възрастните червеи показват значително намаляване на продължителността на живота. В допълнение, нокдаунът на гена xbp-1, който кодира един от основните транскрипционни фактори, участващи в индукцията на UPR ER, води до значително увеличаване на чувствителността към туникамицин (Фигура 5А.) 12. По този начин това служи като надежден тест за измерване на чувствителността на ER към стреса при възрастни червеи.

За да измерим оксидативния стрес и митохондриалния стрес, ние излагаме животните на химичния агент паракват. Паракватът причинява митохондриален стрес чрез синтезиране на ROS в митохондриалната матрица, който след това може да се превърне във водороден пероксид и да се дифузира извън митохондриите, за да причини окислително увреждане на цели клетки 13. Подобно на ER тестовете за стрес, ние излагаме животните на параквати в зряла възраст. Ние обаче правим течни тестове за параквати, за да намалим разходите и ръчния труд, а анализите, базирани на агарни плочи, биха били трудни за повечето лаборатории. Тук показваме, че животните, изложени на паракват в течна течност, имат средно оцеляване около 5 часа (Фигура 5Б.). В допълнение, нокдаунът на инсулиновия рецептор daf-2 води до повишена устойчивост на паракват, тъй като активирането на DAF-16/FOXO води до повишена експресия на видовете, участващи в клирънса на ROS, напр. Б. Sod-3 42, 43. Тестовете за оцеляване на паракват са кратки, продължават до 14 часа и по този начин служат като ефективен метод за поставяне под въпрос на митохондриалните и оксидативните стресови реакции.

Таблица 3: Транскрипционен репортер за оценка на активирането на клетъчните реакции на стрес. Изброените тук щамове са достъпни чрез CGC или чрез специфични лабораторни запитвания за използване в качествените и количествени образни процедури, описани в този ръкопис. Всички тези щамове са получени от фона на Бристол N2. Препоръчани са и методи за прилагане на стрес за активиране на репортерите. Всички репортери, с изключение на sod-3p: GFP 45 и T24B8.5p: GFP 46, са описани в текста.

Трансгенен	Препоръчително приложение (и) на опън	Време на експозиция със стерео микроскоп Leica M2250FA	Време на излагане с микроскоп Revolve ECHO	Стойности на PMT с органичен сортирач Union Biometrica COPAS
hsp-4p: GFP	25 g/ml туникамицин (приблизително 4 часа с нощно възстановяване)	200 ms	275 ms	450
hsp-6p: GFP	3 М антимицин А (около 16 часа);	100ms	50 ms	350
	RNAi срещу ETC или митохондриална рибозома (от люка)
hsp-60p: GFP	3 М антимицин А (около 16 часа);	200 ms	100 ms	450
	RNAi срещу ETC или митохондриална рибозома (от люка)
hsp-16.2p: GFP	34 ° C 2 часа	400 ms	200 ms	500
hsp-70p: GFP	34 ° C 2 часа	400 ms	300 ms	500
gst-4p: GFP	50 mM паракват (приблизително 2 часа);	100 ms	50 ms	350
	2 mM трет-бутил хидропероксид (приблизително 4 часа с нощно възстановяване)
sod-3p: GFP	RNAi срещу Daf-2 (инсулинов рецептор)	300 ms	300 ms	475
T24B8.5p: GFP	Излагане на патоген (напр. P. aeruginosa)	100 ms	50 ms	350

Таблица 4: Препоръчителни настройки за флуоресцентна микроскопия и количествено определяне с биосортер с големи частици. Тази таблица е предназначена за ръководство за препоръчителни времена на експозиция за флуоресцентна микроскопия или стойности на PMT за биосортера с големи частици. Те служат като добри изходни точки, но времето за експозиция и стойността на PMT трябва да се коригират за всеки експеримент, за да се гарантира, че не настъпва насищане и че стойностите на флуоресценцията са над границата на откриване на фоновия сигнал. Ако пробата с най-ярък сигнал е известна за експеримент (например положителни контроли за индукция на напрежението), тези проби могат да се използват за определяне на най-високото време на експозиция или PMT, които могат да се използват без сигнал за насищане. Ако най-ярките проби не са известни, може да се използва контролерът и да се използва времето за експозиция или PMT в средата на динамичния диапазон на вашата система.

Таблица 6: Препоръчителни генни мишени и двойки праймери за измерване на транскрипционното повишаване на регулацията на гените за реакция на стрес.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Друго ограничение на описаните методи е, че изображенията и количественото определяне от биосортер имат ограничена производителност. Въпреки че количественото определяне на биосортерите в 96-ямкови плаки може да се направи за по-висока производителност, то все още е ограничено от необходимостта от прехвърляне на червеи в разтвор, докато изобразяването е ограничено от способността на проверяващия да подготвя червеи и да извършва микроскопия е ограничено. Следователно големите екрани най-вероятно ще включват само визуално екраниране на флуоресцентния репортерен сигнал, като само попаденията се картографират и количествено определят.

Всички методи, описани тук, могат да се използват самостоятелно или в комбинация за цялостен анализ на гени или лекарства от интерес и техните ефекти върху стресовата реакция. Екраните с голям формат могат да се изпълняват с анализи на репортери с висока производителност, а вторичните екрани с количествен анализ на тези репортери. Веднага щом отново бъдат идентифицирани управляеми списъци с генни/лекарствени препарати, могат да се проведат физиологични тестове за идентифициране на кандидатите, които имат пряко въздействие върху цялостната физиология на животните. Другите методи, предложени по-горе, също могат да се използват за валидиране или по-нататъшно проучване.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

---