Ефект на ограничаване на калориите върху чревната пропускливост, възпалителните маркери и фекалиите

субекти

абстрактно

Въведение

Въз основа на наблюдението, че затлъстяването е свързано с хронично, силно възпалително състояние и евентуално нарушена чревна пропускливост 7, настоящото проучване има за цел да изследва дали ограничаването на калориите може да модулира чревната пропускливост и по този начин да намали маркерите на възпалението при хората. Освен това бяха изследвани разнообразието и съставът на чревната микробиота, както и тяхната възможна връзка с чревната пропускливост и възпаление.

Резултати

Диетата с формула с намалени калории води до загуба на тегло

Двадесет жени (на средна възраст 46, 8 ± 11, 5) са били включени в проучването и нито един участник не е отпаднал. Физическите и биохимичните характеристики на участниците преди интервенцията, непосредствено след хипокалоричната диета и 14 дни след интервенцията са показани в Таблица 1. Участниците бяха помолени да се хранят диетично (800 kcal/ден) и допълнително 200 g зеленчуци. В сравнение с първоначалния прием на калории от 1698, 1 ± 592, 7 kcal/ден, тази интервенция причинява значителен енергиен дефицит (P 23, 24, показва значително намаляване след ограничаване на калориите (P 25. Плазмената концентрация в началото на проучването се увеличава значително след 4-седмична хипокалорична интервенция) от (P

( а - д ) Графични графики, базирани на прагови стойности на цикъла (CT) на биопсии на мастна тъкан от 18 участници преди и след 4-седмичното ограничение на калориите. ( д ) За диаметъра на мастните клетки бяха налични данни от 8 участници. *** P 2 и намален до 4020 ± 773 μm 2 (n = 8, P = 0,31).

Интервенциите предизвикаха индивидуални промени в профилите на микробиотата в изпражненията

ограничаване

За да правим разлика между намаляване на калориите и загуба на тегло, проучихме участниците, след като се върнахме към балансирана диета за поддържане на теглото в продължение на две последователни седмици. Данните показват, че повечето от промените, наблюдавани при нискокалоричната диета, са изчезнали, което предполага, че тези промени се дължат главно на острото и дълбоко ограничение на калориите, а не на умереното намаляване на телесното тегло, изпитвано от участниците не наддават значително тегло през двете седмици на проследяване.

Както се очакваше, плазмените концентрации на възпалителния маркер hsCRP бяха намалени след VLCD, което е в съгласие с литературата 28. Също така измерихме циркулиращия LBP като сурогатен маркер за транслокацията на компонентите на клетъчната стена от грам-отрицателни бактерии, термин, известен като течаща чревна асоциирана ендотоксемия 9. Намаляването на калориите е довело до доста скромно намаляване на нивото на LPB 29, което е в съгласие с резултатите от измерванията на чревната пропускливост и евентуално свързаното намаляване на възпалителните маркери. Дизайнът на изследването обаче не позволява да се направят ясни заключения относно възможната причинно-следствена връзка между транслокацията на ендотоксин и системното възпаление.

Плазмените нива на лептин са намалели значително, докато HMW адипонектинът се е увеличил след интервенцията. За разлика от това, нивата на MCP-1 останаха непроменени. Едно от обясненията може да бъде, че средната загуба на тегло от 7% е твърде малка, за да има по-голям ефект върху маркерите за възпаление, свързани със затлъстяването 30. В допълнение, промените в генната експресия за избрани маркери в мастната тъкан - с изключение на лептина - вероятно са били малки поради ограничената загуба на тегло. Въпреки значителното намаляване на теглото, не се наблюдава значително намаляване на размера на мастните клетки на подкожната мастна тъкан в корема. Въпреки това, има тенденция към намаляване на средния размер на адипоцитите. Verhoef et al. показа, че 10% загуба на тегло медиира значително намаляване на размера на адипоцитите 31 .

Интервенцията също е свързана с повишена честота на по един OTU в рода Ruminococcus и Bifidobacterium, който включва както продукти на разграждането на храната от сложни полизахариди, така и получени от гостоприемника полизахариди 40. Santacruz, et al. също показва увеличение на qPCR броя на Bifidobacterium spp. след загуба на тегло (-6,9 кг) при затлъстели юноши след 10 седмици намаляване на калориите 41 .

Силата на нашето проучване се крие в строгата стандартизация и изчерпателно фенотипизиране на участниците. В допълнение се използва широк спектър от различни методи за характеризиране на влиянието на VLCD върху чревната пропускливост: метаболитният статус се оценява с oGTT; Състоянието на възпаление беше изследвано с помощта на различни циркулиращи параметри и генна експресия в проби от мастна тъкан. Резултатите бяха допълнително подкрепени от данни, свързани с чревната микробиота, които следваха индивидуален модел. Необходими са допълнителни проучвания, за да се разберат по-добре тези разнородни отговори.

В заключение, нашите данни показват, че 4-седмичната VLCD диета има благоприятен ефект върху чревната бариерна функция при затлъстелите жени, която бързо изчезва след връщане към нормална диета. Възможната причинно-следствена връзка между промените в чревната пропускливост и промените, наблюдавани в метаболитните и възпалителни биомаркери, както и при някои прицелни бактерии, се нуждае от допълнително проучване.

Участници и методи

Протоколът за изследване е проверен и одобрен от комисията по етика на Медицинския факултет на Техническия университет в Мюнхен (одобрение № 5499/12). Изследването се основава на насоките на Международната конференция за хармонизиране на добрите клинични практики и Хелзинкската декларация (в преработената версия от Сеул, Южна Корея, 2008 г.). Писмено информирано съгласие е получено от всички участници преди включването в проучването. Изследването е вписано в немския регистър за тестове (DRKS00006210). Датата на регистрация за тестовия регистър по немски език е 11 юни 2014 г.

Участници в проучването

Двадесет участници с ИТМ ≥ 30 kg/m² бяха наети през октомври 2013 г. чрез реклами в района на Мюнхен. Допустимостта за участие беше оценена с помощта на подробен скринингов въпросник с подробности за медицинската история. Критериите за изключване бяха: ИТМ

ограничаване

Уча дизайн. Схемата дава преглед на графика и различните проведени изследвания. Съкращения: BS, кръвна проба; FB, биопсия на мазнини; FS, проба на изпражненията; GP, чревна пропускливост; IC, индиректна калориметрия; ЯМР, ядрено-магнитен резонанс; NC, Хранителни съвети; PE, физически изпит; oGTT, орален тест за глюкозен толеранс; въпросник.

Диетични протоколи

Участниците в изследването са инструктирани да записват консумацията на храна през целия период на изследване. Енергийното съдържание и съставът на макроелементите в диетите са изчислени с помощта на софтуера OptiDiet Plus (версия 5.1.2.046, GOE mbH, Linden, Германия).

Антропометрични измервания

Антропометричните и клинични измервания бяха стандартизирани между 8 и 9 сутринта след пост през нощта. Теглото и съставът на тялото са измерени с помощта на анализатора за състав на тялото TANITA тип BC-418 MA III (Амстердам, Холандия). Скоростта на метаболизма в покой (RMR) е измерена с помощта на сенник (COSMED Quark RMR, Fridolfing, Германия).

Кръвни проби и биохимичен анализ

Взети са кръвни проби на гладно. Липидните параметри (общ холестерол, LDL-c, HDL-c, триглицериди), чернодробни ензими (аспартатна трансаминаза (AST), аланин трансаминаза (ALT), γ-глутамилтрансфераза (γ-GT)), креатинин, пикочна киселина и глюкоза на гладно са определени от SynLab (Мюнхен, Германия) анализирани. Събира се допълнителна кръвна проба, центрофугира се незабавно (2500 g за 10 минути при 20 ° C) и след това се съхранява при -80 ° C до анализ. Лептин, Чемерин, hsCRP, RANTES, MCP-1, HMW-Adiponektin и LBP (всички: R&D, Wiesbaden, Германия), инсулин (Dako, Glostrup, Дания) и зонулин (Immundiagnostik AG, Bensheim, Германия) бяха в плазмата изследвани с използване на налични в търговската мрежа ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA). Фекалният калпротектин се измерва с помощта на ELISA (CALPROLAB ™ Calprotectin ELISA (HRP), FROST Diagnostika GmbH, Otterstadt, Германия). Всички ELISA бяха проведени, както е описано от производителите. NEFA бяха измерени с помощта на търговски комплект за тестване (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Германия). Инсулиновата резистентност се изчислява, като се използва HOMA-IR [HOMA-IR = инсулин (μU/ml) × глюкоза (mmol/l)/22, 5] 42.

Тест за орален глюкозен толеранс

Тестовете за орален глюкозен толеранс (OGTT) започват между 8 и 9 сутринта след еднодневно гладуване от 12 часа. След вземане на основна кръвна проба субектите са получили 75 g глюкоза в обем от 300 ml (AccuCheck®-OGT, Roche, Mannheim, Германия). След 30, 60 и 120 минути се взема кръв и се определя нивото на глюкозата (HemoCue Glucose 201 +, калибрирана в плазма, Енгелхолм, Швеция).

Чревна пропускливост

Обструктивната функция на червата беше оценена с помощта на различни неинвазивни тестове. Първо, чревната пропускливост беше измерена с помощта на валидиран тест за абсорбция на захар и тест с PEG. И двата теста бяха проведени паралелно. Принципът е да се измерва отделянето с урина на перорално приложени вещества с различни молекулни маси. Тестовете са извършени непосредствено преди процедурата, след процедурата и две седмици след процедурата. Данните са представени като процент на погълната захар и процент на ПЕГ, открити в урината. Тези стойности се означават като% възстановяване на урината. И накрая, маркерът за чревна пропускливост зонулин беше измерен в кръвта с помощта на ELISA.

Тест за усвояване на захарта

Тестът за усвояване на захарта се провежда, както е описано от Norman et al. 43. Захарите се определят количествено чрез високоефективна течна хроматография с импулсно електрохимично откриване (хроматографски модул: 250, Dionex, Idstein, Германия) 43.

Тест за абсорбция на полиетилен гликол

Участниците получиха 100 ml тестов разтвор на PEG с 1 mg молекулно тегло (Mr) 400 (PEG 6 -PEG 13; масов диапазон: 285-678 Da), 200 mg Mr 1500 (PEG 20 -PEG 45; маса) диапазон: 899-2,000 Da), 4 g Mr 3000 (PEG 51 -PEG 90; масов обхват: 2 264-3 982 Da) и 4 g Mr 4000 (PEG 75 -PEG 115: масов обхват: 3 322-5 084 Da) (Merck Darmstadt, Германия). Пет часа след поглъщането на разтвора за захарен тест, разтворът за изпитване на PEG се изпива и се вземат проби от урина през следващите 24 часа. PEGs са анализирани чрез течна хроматография-масспектрометрия, както е описано от Lichtenegger и Rychlik 44 .

Коремна биопсия на подкожната мастна тъкан

Проби от подкожни мазнини на корема са получени чрез аспирация с игла преди и след диетата по рецепта. След измиване в буфер на Krebs-Ringer, мастната тъкан се разделя на епруветки, съдържащи стерилизирани циркониеви стъклени мъниста (Carl Roth, Karlsruhe, Германия), RLT буфер (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Германия) и 1% (v/v ) β-меркаптоетанол (# M3148, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и след това незабавно замразен и съхраняван при -80 ° C. За хистология на мазнините мастната тъкан се фиксира в 4% буфериран формалин (рН 7,4) за 24 часа и накрая се вкарва в парафин и се съхранява при стайна температура до анализ. Размерът на адипоцитите се определя с помощта на софтуера за анализ на изображения с отворен код cellprofiler® (http://www.cellprofiler.org/).

Количествена полимеразна верижна реакция

Проби от изпражнения

Проби от изпражнения се събират директно в стерилни пластмасови контейнери (1000 ml; VWR International, Мюнхен, Германия). След това участниците бяха помолени да вземат пластмасова лъжица от едно място от фекалния материал в епруветка за събиране на изпражнения с 8 ml ДНК стабилизиращ буфер (Stratec Molecular GmbH, Берлин, Германия). След това пробите от изпражненията бяха незабавно замразени при -18 ° C до следващото посещение. Участниците транспортираха замразените проби на изпражненията до лабораторията с помощта на охлаждащи устройства. И накрая, епруветките за събиране веднага се съхраняват при -80 ° C.

16 Последователност на ампликон на S-рибозомна РНК с висока производителност

Пробите са обработени, както е описано по-горе 48. Накратко, клетките се лизират чрез гранулиране и термична обработка и метагеномната ДНК се пречиства с помощта на gDNA колони (Macherey-Nagel, Düren, Германия). Концентрациите и чистотата бяха проверени с помощта на системата NanoDrop® (Thermo Scientific Waltham, Масачузетс, САЩ). V3/V4 регионът на 16 S-рибозомни РНК (rRNA) гени се усилва от 24 ng ДНК, като се използват праймери 341 F и 785 R 49 (25 цикъла). След пречистване (система AMPure XP, Beckmann Coulter Biomedical GmbH) и обединяване в еквимоларни количества, ампликоните на 16 S-rRNA гена бяха в режим на сдвоени краища (PE275), използвайки система MiSeq (Illumina, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) секвенирани. САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя и крайна концентрация на ДНК от 10 рМ и 15% (v/v) стандартна библиотека PhiX.

Анализ на последователността

Файловете за четене в необработен вид бяха обработени въз основа на подхода UPARSE 50, използвайки IMNGS 51. Последователностите бяха тествани за присъствие на химери с помощта на UCHIME 52 и OTUs бяха групирани при праг от 97% сходство на последователността. За да се избегне анализът на неправилни OTU, в поне една проба се съхраняват само тези с относителна честота> 0,5% от общите последователности. SILVA (SILVA Incremental Aligner Version 1.2.11) 53 и RDP класификаторът (изречение 15; 80% сигурност) 54 са използвани за присвояване на таксономична класификация на последователностите, представителни за OTU. Специфични OTU с различни честоти между групите бяха допълнително идентифицирани с EzTaxon. Филогенетичните връзки бяха изследвани с помощта на обобщения метод UniFrac 55. Ефективният брой на Шанън е използван за оценка на вътрешнопробното разнообразие (алфа разнообразие), както е описано от Jost et al. 56 .

Статистически анализ

Данните бяха анализирани в програмната среда на R. Антропометричните и метаболитните данни са представени като средно ± стандартно отклонение. Използвани P-стойности 57. Ефектът на VLCD върху OTU и таксономични преброявания е тестван с помощта на теста на Friedman Rank за анализ на непараметричен рандомизиран блок дизайн. Липсващите стойности бяха третирани с теста Skillings Mack. Тестът на Wilcoxon за подписване на ранг за съвпадение на двойки е използван за двойни сравнения. Методът на Бенджамини-Хохберг е използван за корекция след няколко теста. За анализа на бета разнообразието бяха изчислени обобщени разстояния на UniFrac с пакета GUniFrac 55.

Денят на благодарността

Благодарим на Dr. Клаудия Айххорн за извършване на аспирация на иглата, Юлиус Хонекер за отличната подкрепа при измерване на размера на мастните клетки, Dr. Карин Норман за нейната подкрепа при измерването на чревната пропускливост, Мануела Хуберсбергер за отличната й техническа поддръжка и Каролайн Циглер в ролята на Ангела Заксенхаузер от ZIEL Core Facility Microbiome/NGS за отличната й подкрепа при подготовката на проби за последователност с висока производителност. Това проучване е финансирано от BMBF (Федерално министерство на образованието и научните изследвания, грант № 0315674). Диетичната рецепта е любезно предоставена от Nutrition Santé SAS (Revel, Франция).

Допълнителни електронни материали

Допълнителен файл

Забележки

Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.