Влияние на утаяването на цинк и липиди върху 3,2-еноил-КоА изомеразата и избрани характеристики
1 Влияние на седиментацията на цинк и липиди върху 3,2-еноил-КоА изомеразата и избрани характеристики на липидния метаболизъм на растящи плъхове Дженифър Юстус Встъпителна дисертация за получаване на докторска степен (д-р oec. Troph.) Във Факултета по земеделски науки, екотрофология и управление на околната среда на Justus- Университет Либиг Гисен
3 От Института по хранене на животните и хранителна физиология към Университета Justus Liebig в Гисен Влияние на седиментацията на цинк и липиди върху Δ 3, Δ 2 -еноил-КоА изомераза и избрани характеристики на липидния метаболизъм при растящи плъхове Инаугурационна дисертация за получаване на докторска степен (д-р oec . troph.) във факултет 09 - Селскостопански науки, екотрофология и управление на околната среда на университета Justus Liebig Giessen, представен от Dipl. oec. трофей. Дженифър Юстус Гисен 2007
4 Дисертация във Факултета по селскостопански науки, хранителни науки и управление на околната среда в университета Justus Liebig в Гисен Декан: проф. Д-р Изпитна комисия на Р. Херман: председател: проф. Д-р И. Хофман 1-ви рецензент: проф. Д-р E. Weigand 2-ри рецензент: проф. Д-р Й. Палауф Изпитващ: проф. Д-р Х. Брюкнер Изпитващ: PD Dr. Ден на спора на С. Рудлоф: 22 януари 2007 г.
5 Съдържание I Съдържание Списък на фигурите. IV Списък на прегледите. V Списък на приложения и таблици. VII Списък на съкращенията. IX 1 Въведение Дефицитът на цинк и неговото влияние върху липидния метаболизъм Микроелементът цинк Дефицит на цинк Биологични функции на цинка Метаболизъм на цинка и определяне на състоянието на цинк Регулиране на генната експресия чрез цинк Промени в липидния метаболизъм и специфичен метаболизъм на ненаситени мастни киселини Промени в липидния метаболизъм при дефицит на цинк Деградация на ненаситени мастни киселини и функция на Δ 3, Δ 2 -Еноил- КоА изомераза Експресионен модулаторен потенциал на ненаситени мастни киселини Експериментална част Изследователски въпрос Описание на експеримента Състав на експерименталните диети Получаване и обработка на аналитичния материал Аналитични методи Хемоглобин, хематокрит Мастно съдържание във фекалиите Определяне на цинковия статус Концентрации на протеин Активност на Δ 3, Δ 2 -Еноил-КоА изомеразна субстрат Възстановяването на митохондриалните фракции Δ3, Δ2-еноил-КоА изомеразен анализ Сукцинат дехидрогеназен анализ Генна експресия анализира екстракция на обща РНК. 37
6 II. 2 -еноил-КоА изомераза мрна-експресия на Δ 3, Δ 2 -еноил-КоА изомеразата и PPARs алфа и гама плазмени липидни липидни фракции на черния дроб мастнокиселинен модел на чернодробните липидни фракции кетонни тела Дискусия Коментар върху животинския модел Растеж и цинков статус на изследваните животни Влияние на утаяването на цинк и липиди върху активността и експресията на Δ 3, Δ 2 -еноил-КоА изомераза Влияние на експресията на PPARalpha, PPARgamma и кетонната телесна концентрация Ефекти върху липидния профил на плазмата и черния дроб Влияние на цинка - и липидно утаяване върху модела на мастните киселини на общите липиди, триглицериди и фосфолипиди на черния дроб Заключение Резюме Библиография Приложение. 106
7 Съдържание III Обобщение Резюме Обяснение. 136
10 VI Съдържание Общ преглед 23: Общ преглед 24: Общ преглед 25: Общ преглед 26: Общ преглед 27: Относително общо съдържание на липиди, холестерол, триглицериди и фосфолипиди в черния дроб (mg/100 g живо тегло). 59 мастни киселини от общите липиди в черния дроб (g/100g общо мастни киселини). 61 мастни киселини от общите чернодробни липиди (mg/g чернодробни FM). 64 мастни киселини от чернодробната триглицеридна фракция (g/100 g общо мастни киселини). 66 мастни киселини от чернодробната фосфолипидна фракция (g/100 g общо мастни киселини). 67
12 VIII Съдържание Таблица A 23: Таблица A 24: Концентрации на 3-хидроксибутират в плазмата и в урината от периода на събиране FS метилов естер в сместа FAME C4-C24 (18919, Sigma) Таблица A 25: LCQ данни Фигура A 1: Молекулярна структура и молекулно тегло на транс-3-хексеноил-коа Фигура А 2: Масови спектри на пречистения транс-3-хексеноил-коа, положителен режим отгоре, отрицателен режим отдолу Фигура А 3: Протокол на 3-НВ автомобилния комплект (Wako Chemicals). 132
13 Съдържание IX Списък на съкращенията 3-HB 3-хидроксибутират AI Адекватен прием ALA алфа-линоленова киселина AP Алкална фосфатаза BHT Бутилхидроксилтолуен BSA Говежди серумен албумин Chol Холестерол CoA Коензим A CRIP богат на цистеин чревен протеин d ден DCIP 2,6-дихлоро дихлорид 2,6-дихлор 1 (също Nramp2) DEPC диетилпирокарбонат DHA докозахексаенова киселина DRI Диетичен референтен прием DTNB 5,5-дитиобис (2-нитробензоена киселина) ECI Δ 3, Δ 2 -еноил-КоА изомераза EPA ейкозапентаенова киселина f фактор на разреждане FAME мастна киселина метилов естер FID мастна киселина метилов естер FS -3-фосфат дехидрогеназа GC газова хроматография GFS наситени мастни киселини (диета с какаово масло) GL общо липиди Hb хемоглобин Hk хематокрит HNF-4 чернодробен ядрен фактор-4 hzip4 човешки zrt-, ирт-подобен протеин 4 hztl1 човешки ZnT-подобен транспортер 1 ICP-AES Индуктивно куплиран плазмен атомно-емисионен спектрометър е вътрешен стандарт LM разтворител M Средно
14 X Съдържание MFE1 Мултифункционален ензим 1 минута MRE Метален отговорен елемент MT Metallothionein MTF1 MRE-свързващ транскрипционен фактор-1 MUFS полиненаситени мастни киселини n.n. не се открива, количество под границата на откриване ns не е значително p Вероятност за грешка PC фосфатидилхолин PCR полимеразна верижна реакция PL фосфолипид PP пероксизомен пролифератор PPAR пероксизомен пролифератор активиран рецептор PPRE PPAR-отговор елемент RDA Препоръчителна диетична добавка RT Обратна транскриптаза RXR SDHrogen Стандартно отклонение XHrogen Стандартна девизия SREBP-1 Стерол, регулиращ елемент, свързващ протеин-1 T a TAE TG T m TM TMSH Температура на отгряване Трис-ацетат-EDTA-буфер Триглицерид Температура на топене Сухо вещество N-триметилсулфониев хидроксид U Ензимна активност (единица, оборот на субстрата в µmol мин -1) UFS ненаситен Мастни киселини (диета с шафраново масло) UL Допустимо горно ниво на прием v Обем срв. сравнение срещу спрямо w тегло Zn цинк ZnT-1 цинк транспортер-1
19 Преглед на литературата 5 лиганда, свързани: с три аминокиселини (His, Glu, Asp или Cys) и водна молекула. Цинкът се фиксира от три His в карбоанхидразата и от His-Glu-His в карбоксипептидазата (VALLEE и AULD 1990, MCCALL et al. 2000); отсъствието на цинк води до загуба на каталитична активност. Като структурен компонент, цинкът е тетраедрично свързан с четири аминокиселини (Cys или His) и влияе върху локалната конформация и стабилността на ензима (Фигура 1 А). AB Фигура 1: Цинкови структури (A) в цинковите металоензими, (B) в ДНК свързващите домейни на транскрипционни фактори (съгласно VALLEE и AULD 1992) Цинкът също така определя триизмерната структура на цинковите пръсти, цинковия клъстер и цинковите ротационни протеини, група цинк-съдържащи транскрипционни фактори ( Фигура 1 Б). Цинковите протеини на пръстите са сред най-често срещаните протеини в еукариотния геном, които поради своята триизмерна конформация могат да взаимодействат директно с ДНК. Някои от техните разнообразни функции в транскрипционната регулация все още се изясняват (LAITY et al. 2001). Cys 2 His 2 и Cys 3 His цинкови пръсти също могат да разпознават специфични РНК последователности чрез различни механизми и да се свързват с тях (HALL 2005).
24 10 Преглед на литературата 2.2 Регулиране на генната експресия с цинк Както каталитичната, така и структурната, както и регулаторната функция на цинка са свързани с влияние върху генната експресия (прегледано от VALLEE и FALCHUK 1993, COUSINS 1998, DREOSTI 2001). Като съществена стъпка в транскрипцията, синтезът на РНК се осъществява чрез каталитичната активност на РНК полимерази, които като металоензими изискват два атома цинк. Важността на структурната функция на цинка се разкрива най-впечатляващо от мотивите на цинковите пръсти: Структурата на пръста с форма на цикъла се създава, когато цинковият атом е тетраедрично комплексиран от цистеинилови или хистидилови остатъци от пептидната верига (Фигура 1 Б). Това е предпоставка за взаимодействие с ДНК. Според нови изчисления 10% от човешкия протеом са потенциално свързващи цинка протеини (ANDREINI et al. 2006), най-многобройният клас от които са цинковите пръсти, повечето от които функционират като транскрипционни фактори. Цинк реагиращи гени физиологична модулация директна регулация вторични медиатори регулирана транскрипция регулирана транскрипция mrnas протеини Фигура 3: Възможни нива на влияние на цинка върху генната експресия (след COUSINS 1998)
58 44 Експериментална част, Общ преглед 14: GC параметри и температурни програми за определяне на модела на FS Откриване: FID горивни газове: H 2 (35 ccm/min) синтетичен въздух (250 ccm/min) газ за грим N 2 (25 ccm/min) Автосамплер: Chrompack Type 910 Инжектиране: Разделен обем: 1 µl Вложка: Стъклено дъно на звънеца Газ-носител: H 2 липидни екстракти: Разделен поток: 25 ccm/min Предварително налягане на носещ газ: 80 kpa Температурна програма: 200 C, 2 C/min до 220 C 220 C 45 мин. триглицериден елуат: разделен поток: 20 ccm/min приемно налягане на носещ газ: 60 kpa температурна програма: 220 C 23 min 2 C/min при 230 C 230 C 35 min фосфолипиден елуат: разделен поток: 15 ccm/min приемно налягане на носещ газ: 55 kpa Температурна програма: 220 C 20 min 4 C/min до 235 C 235 C 25 min
59 Експериментална част 45 Степента на възстановяване на стандарта FAME се проверява редовно (след 2 до 3 проби) и за оценка се използват поне три GC проби на проба. В анализа не бяха включени пикове, които не можеха да бъдат присвоени на нито един FS. Границата на количественото определяне беше 0,05% до 0,2% (тегл./Тегл.) От общите мастни киселини, в зависимост от индивидуалното FA и съдържанието на липиди в екстракта. Хроматограма на стандарта FAME е показана на фигура 7. Пълните имена на съдържащите се FAME са дадени в приложението. Фигура 7: GC хроматограма на FAME-Mix C4-C кетонните тела в плазмата и урината Концентрацията на 3-хидроксибутират (3-HB) в плазмата и урината се определя с помощта на 3-HB автокит (Wako Chemicals). Протоколът за определяне е даден в приложението. Използвани са 8 µl плазма или 20 µl урина и за определяне на празната стойност aqua bidest. Стандартът 3-HB (Ketone Body Calibrator 300) се разрежда според обема на пробата. Концентрациите на 3-HB в плазмата и урината се определят по два екземпляра при пет животни на група.