Влияние на метотрексат върху метаболизма на хомоцистеин Проучвания върху левкемия и
1 Влияние на метотрексат върху метаболизма на хомоцистеин: проучвания върху пациенти с левкемия и лимфом Дисертация за получаване на докторска степен (д-р рен.) На математическия и естественонаучен факултет на Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, представен от ACHIM BECKER от Трир Бон 2004
2 Изготвено с разрешение на Факултета по математика и естествени науки на Rheinische-Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn. Тази дисертация е публикувана по електронен път на университетския сървър за публикации на ULB Бон. 1. Лектор: проф. Д-р U. Jaehde 2-ри лектор: проф. Д-р Ден на дипломирането на Г. Бенда:
4 Бих искал специално да благодаря на моята приятелка Юта Шнайдер за търпението и готовността да помогне, особено в последната фаза на работата. И накрая, бих искал да благодаря на майка ми и моите братя и сестри, които винаги ме подкрепяха и винаги ми даваха надеждна подкрепа дори в трудни моменти.
5 Семейното ми съмнение не е удобно, но сигурността е абсурдно. Волтер
6 Съдържание 1 Въведение Хомоцистеин Метаболизъм на хомоцистеин Причини за хиперхомоцистеинемия Клинични симптоми на хиперхомоцистеинемия и терапевтични препоръки Патомеханизми Метотрексат Химическа структура Фармакокинетика Механизъм на действие Клинични приложения Невротоксичност на MTX Проблеми и цели Материали и методи Материали Химикали и реагенти Анализи на химикали и реагенти Използвани разтвори Химични вещества и реагенти Консумативи за химикали и реагенти. 35
7 Съдържание Основи на капилярната електрофореза Разработване на система за разделяне за определяне на възбуждащи аминокиселини, съдържащи сяра (SEAA) Разработване на метод Оптимизация на метода за определяне на SEAA в течността Валидиране на метода CE Измерване на течни проби HPLC анализ HPLC система и хроматографски условия Редукция и деколонизация на предколона на аминотиол -оптимизационен метод валидиране измерване на проби от CSF проби флуоресценция поляризация имуноанализ принцип на флуоресценция поляризация имуноанализ изпълнение на спецификациите за измерване на системата IMx валидиране на метода FPIA от производителя частично валидиране на метода FPIA за определяне на хомоцистеин при плазмени клинични изследвания педиатрични пациенти с остра лимфоцитна левкемия. 68
8 Съдържание Възрастни пациенти с първичен лимфом на централната нервна система Здрави възрастни (контролна група) Доклад за случай на пациент с предозиране с MTX Фармакокинетични изчисления Клирънс AUC Статистически анализ на данни Описателна статистика Статистически тестове за тестване на диференциални хипотези Корелационен анализ Регресионен анализ Резултати CE метод за определяне на възбуждащи аминокиселини, съдържащи сяра в CSF Разделяне на възбуждащи аминокиселини, съдържащи сяра Оптимизация на дериватизация Сравнение на чувствителността на UV и LIF откриване Метод оптимизация за анализ на CSF Валидиране HPLC метод за определяне на цистеин, хомоцистеин и глутатион в CSF. 111
9 Съдържание Разработка/оптимизация на метода Валидиране на метода HPLC Резултати от частичното валидиране на FPIA Влияние на високи дози MTX върху метаболизма на хомоцистеин Изследвания при педиатрични пациенти с остра лимфобластна левкемия (Проучване Общо XV) Изследвания при пациенти с PZNSL Предозиране Дискусия CE метод за определяне на възбуждащи аминокиселини, съдържащи сяра в CSF HPLC метод за определяне на хомоцистеин, цистеин и глутатион в CSF Влияние на високи дози MTX химиотерапия върху метаболизма на хомоцистеин Проучвания при педиатрични пациенти с ALL Изследвания при пациенти с PZNSL Пациент с предозиране на MTX Хомоцистеинът е биомаркер на индуцирана от MTX невротоксичност? Обобщена литература Приложение. 222
10 Списък на съкращенията ABDF AG AICAR AICAR-TF AK AL ALL ASP ATP BHMT C1 (8), (15) C1h23 (42) C15h23 (42) CA CBQCA CBS CGL CFSE cp ss CNS CSA CV CYS DAMPA DHB DHF DHFR DHP DHPR 4- ( Аминосулфонил) -7-флуоро-бензофуразан антиген аминоимидазол-карбоксамид-рибонуклеотид аминоимидазол-карбоксамид-рибонуклеотид трансформилаза антитяло работен разтвор остра лимфна левкемия L-аспарагинова киселина (аспартат) аденозин трифосфат бетаин 1-ви ден или 1-ви ден хомоцистет 1-ви ден или 1-ви ден хомецистел или 1-ви ден хомоцистет 1-ви ден или 1-ви ден хомоцистет 1-ви ден или 1-ви ден хомецистел или 1-ви ден хомоцистет или 1-ви ден хомецистера или 1-ви ден на ден. на консолидация 1-ви ден на консолидация, 23 (42) часа след началото на инфузията с високи дози MTX 15-и ден на консолидация, 23 (42) часа след началото на инфузията с високи дози MTX Цистеин сулфонова киселина 4- (2-формил-3-хинолин карбонил) -бензоена киселина цистатионин-ß-синтаза цистатионин-γ-лиаза 5-карбоксифлуоресцеинсукцинимидилов естер стабилна концентрация в плазмата централна нервна система (централна нервна система) цистеин сулфинова киселина вариационен коефициент (вариационен коефициент) цистеин 2,4-диамино-N 10-метил-p тероева киселина дихидробиоптерин дихидрофолиева киселина (дихидрофолат) дихидрофолат редуктаза дихидроптеридин дихидроптеридин редуктаза
11 DMF DTT E ECD EDTA EOF FD FDA FGAR FICAR FITC FPGS FPGH FPIA FQCA FR GAR GAR-TF GLU GSH GTP HCY HCSA HCA HDMTX HR ICV ICVMTX IM IMP IT ITMTX IV N, N-диметилформамичен електрохимичен електрохимичен електрохимичен, електрохимичен електрохимичен Food & Drug Administration Formylglycinamidribonukleotid 5-формамидо-имидазол-4-carboxamidribonukleotid флуоресцеин фолиева киселина-фолат Polyglutamatsynthetase Polyglutamathydrolase флуоресцентна поляризация имуноанализ 3- (2-фуроил) хинолин-2-карбалдехид фолат рецептор Glycinamidribonukleotid Glycinamidribonukleotid трансфераза глутаминова киселина (глутамат) глутатион гуанозин трифосфат хомоцистеин Homocysteinsulfinsäure Хомоцистеин сулфонова киселина Терапия с високи дози с метотрексат (прилага се интравенозно) Високорисков Интрацеребровентрикуларен Интрацеребровентрикуларен метотрексат Интрамускулен Инозин монофосфат Интратекално Интратекално прилаган Метотрексат Интравенозно
12 K KPF LDL LIF (D) LLOQ LOD LR MAT ME MP MEKC MeOH mfbp MS MTHFR MTX MTX Контролна група Коригирана площ на пика Липопротеини с ниска плътност Лазерно индуцирана флуоресценция (откриване) Долна граница на количествено определяне (долна граница на количествено определяне) Граница на откриване (граница на откриване) Ниска -Риск метионин аденозилтрансфераза меркаптоетанол меркаптопропанол Мицеларна електрокинетична хроматография метанол мембрано-свързан фолат свързващ протеин метионин синтаза N 5, N 10-Метилен тетрахидрофолат редуктаза метотрексат метотрексат полиглутаматичен електрофореф ЕФ µ e електрофореф F e електрофореф e e електрофореф µ e електрофореф µ e електрофореф EF е N 5 -FTHF N 10 -FTHF NHL N 5, N 10 -MTHF N 5 -MTHF NMDA PRPP PO PZNSL QC-Сонда r N-ацетилцистеин N 5-формил тетрахидрофолат N 10-формил тетрахидрофолат Неходжкинов лимфом N 5, N 10 - Метилен тетрахидрофолат N 5-метил тетрахидрофолат N-метил-D-аспартат α-5-фосфорибозил-1-пирофосфат per os (орално) Първичен лимфом на централния Ne rvensystems коефициент на корелация на пробата за контрол на качеството
13 RE RFC RI ROS RSD S SD SAH SAHH SAM SBDF SDS SEAA SHR SL SR ss t ½ TBP THB THF TIT ULOQ v VK Относителна грешка (относителна грешка) Намалена ремисия/индукция на фолатен носител Относителни стандартни отклонения (коефициент на вариация) Стандартно стандартно отклонение (Стандартно отклонение) S-аденозилхомоцистеин S-аденозилхомоцистеин хидролаза S-аденозилметионин 4- (сулфо) -7-флуоро-бензофуразан натриев додецил сулфат Съдържащи сяра възбудителни аминокиселини (съдържащи сяра, възбуждащи стабилни аминокиселини) стандартен/високорисков рисков запас стандартен/високорисков рисков запас Полуживот трибутилфосфин тетрахидробиоптерин тетрахидрофолиева киселина (тетрахидрофолат) Интратекална тройна терапия Горна граница на количествено определяне (горна граница на количествено определяне) Скорост на миграция Коефициент на вариация x средна стойност x
Медиана Z Трансформиран коефициент на корелация ЦНС Централна нервна система
19 Page 6 Въведение Липсата на пресни плодове и зеленчуци, дефицитът на фолиева киселина е най-често срещаният дефицит на витамини в Европа. Средният дневен прием на фолиева киселина с храна (
25 Page 12 Въведение Хомоцистеин-медиираните невротоксични реакции могат да бъдат значително намалени чрез приложението на NMDA рецепторни антагонисти 67,71,72. Cl - канал Ca 2+ канал каинат NMDA AMPA mglu Na + Na + Na + PLC Cl - Ca 2+ IP 3/DAG протеази (Kalpaine I/II), фосфолипази (PLA 2, PLC), ендонуклеази, протеинкинази (CaMPK II, PKC), NO пероксидация на липади на синтаза, увреждане на цитоскелета, ДНК и митохондрии Осмотичен лизис, апоптоза Фиг. 1-3: Механизъм на екситотоксичност. Съкращения: Kainate: Kainate рецептор; NMDA: N-метил-D-аспартат (рецептор); AMPA: L-α-амино-3-хидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионова киселина (рецептор); mglu: метаботропен глутаматен рецептор; PLC: фосфолипаза С; IP 3: инозитол трифосфат; DAG: Диацилглицерол Обсъжда се също така, че индуцираните от хомоцистеин атеросклеротични промени в мозъчните съдове могат да доведат до исхемия и хипоксия, като по този начин невроните могат да бъдат повредени 77. Цистеинът също се подозира, че причинява невротоксични ефекти при по-високи концентрации. Тази добавена токсичност може да бъде особено важна идват, когато кръвно-мозъчната или кръвно-ликьорната бариера са повредени от инфилтрация с тумори или от лъчение и по-големи количества цистеин могат да попаднат от кръвта в ЦНС.
29 Page 16 Въведение имат подобно MTX и са в състояние директно да инхибират ензимите на биосинтеза на пурин, те са от голямо значение за цитотоксичността (ата). HNN NH 2 NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O COOH MTX карбоксипептидаза алдехид оксидаза HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 фолиева киселина полиглутамат синтетаза HOOC HN HO HNNNN NH 2 CH 3 N NH 2 OO 2,4-диамино-N 10-метилптерова киселина DAMPA) HNN COOH NH 2 7-хидроксиметотрексат (7-OH-MTX) NN HOOC HNN NH 2 CH 3 O CO (GLU) n Метотрексат полиглутамат (MTX-PG) Фиг. 1-5: Метаболизъм на MTX.
32 Въведение стр. 19 Глицинамид рибонуклеотид (GAR) или 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид да престои. 2- O3 PO CH 2 O PRPP OH OOOPOPO - OH O - O - OH 2 NH 2 NN AICAR N Рибоза P 2- O3 PO CH 2 OH O HN OH C CH 2 O GAR NH 2 AICAR-TF X MTX-PG ON 10 -FTHF THF GAR-TF MTX-PG XN 10 -FTHF THF OH 2 N CH HN N FICAR N Ribose PH 2 CCOHN CH O NH Ribose P FGAR OH 2 O HN NN IMP N Ribose P Фиг. 1-7: Взаимодействие с MTX-PG с de novo синтеза на пуринови основи (избрани стъпки). Съкращения: PRPP: α-5-фосфорибозил-1-пирофосфат, GAR: глицинамид рибонуклеотид, GAR-TF: GAR трансформилаза, FGAR: формилглицин амид рибонуклеотид, N 10 -FTHF: N 10-формил тетрахидрофолат, THF: тетрахидрофолат, THF: тетрахидрофолат, THF: тетрахидрофолат, THF 4-карбоксамид рибонуклеотид, AICAR-TF: AICAR трансформазила, FICAR: 5-формамидо-имидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид, IMP: инозин монофосфат.