Влияние на индуцируема хем оксигеназа (HO-1) върху микроциркулацията в
1 От клиниката по хирургическа университетска клиника по обща и висцерална хирургия към Университета на Алберт Лудвиг във Фрайбург i.br. Влияние на индуцируема хемоксигеназа (HO-1) върху микроциркулацията при пост-исхемичен панкреатит I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N за получаване на докторска степен от Медицинския факултет на Алберт-Лудвигс-Университет Фрайбург i.br. Представено през 2006 г. от Мориц Шолтес, роден в Аахен
2 2 Декан: проф. Д-р мед. C. Peters 1-ви рецензент: PD Dr. мед. О. Томуш 2-ри рецензент: проф. Д-р мед. Б. Разбивки Година на дипломиране: 2007
4 4 Тази работа беше ръководена от д-р. мед. Е. фон Добшюц
5 5 СЪДЪРЖАНИЕ 1. ВЪВЕДЕНИЕ ОСТРИ ПАНКРЕАТИТ МИКРОЦИРКУЛАЦИЯ ИШЕМИЯ РЕФЕРФУЗИЯ ХЕМЕГРАДАЦИЯ ПО ХЕМОКСИГЕНАЗА Реакцията на хемоксигеназата и нейните продукти желязо СО биливердин и билирубин HO-Изоензим експеримент преди изоензим Анестезия и вентилация Микрохирургичните технологични ПРОВЕРКА МЕТОД Macrohemodynamics Microhemodynamics Функционално капилярната плътност левкоцитноендотелна Лабораторни взаимодействие параметри Определяне на откриване активност HO Northern блот анализ Western блот анализ експериментален протокол за изпитване групи тест процедура контрол условия активност исхемия repaemitis-hemogenase-инхибиране-кислород-инхибираща активност на исхемия-repemeritis-hemogenase-инхибиторна-оксигеназа-инхибиране на активност на активността на исхемия-ре-creatitis-hemogenase-STA-оксигеназа-окисление на панкреаса активност. 35
6 6 4. РЕЗУЛТАТИ МАКРОХЕМОДИНАМИКА МИКРОХЕМОДИНАМИКА Функционална капилярна плътност Левкоцитно-ендотелиално взаимодействие ЛАБОРАТОРНИ ПАРАМЕТРИ ОТКРИВАНЕ НА ХЕМОКСИГЕНАЗА Откриване на активност Северно петно Western blot ОБЗОР ДИСКУСИЯ ДИСКУСИЯ СИВЕРНО-ДИСЛОЦИЯ РЕЗУЛТАТИ Влияние на исхемия и реперфузия Макрохемодинамика Микрохемодинамика Левкоцитно-ендотелно взаимодействие Експресия на хемоксигеназа и активност Влияние на HO Макрохемодинамика Микрохемодинамика Левкоцитно-ендотелиално взаимодействие Експресия и активност на хемоксигеназата. 98
10 10 Тези механизми водят до разстройство на микроциркулацията, което от своя страна води до намалено енергоснабдяване на тъканта и по този начин поддържа порочния кръг (Фигура 1). Na + -K + - АТФаза Na + -Ca 2+ - Антипорт ATP Na + Ca 2+ Протеази XDh O 2 Hyx + XOx Исхемия Кръв-O 2 Реперфузия O 2 -радикална пропускливост Едем Тромбоза Съсирване на левкоцити Деградация на ECM Увреждане на мембраната Микроциркулационно разстройство Активиране на левкоцитите Увреждане на клетките Ендотелни увреждания Ензими Цитокини Фигура 1: Порочен кръг на исхемично-реперфузионно увреждане: Процесите при исхемия (горе) причиняват увреждане на клетките при реперфузия (отдолу), което води до допълнително хипоксично увреждане на тъканта
17 17 2. ЦЕЛ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО Целта на настоящото експериментално проучване е да изследва ефектите от едночасова исхемия и двучасова реперфузия върху микроциркулацията на панкреаса. Беше изследвано дали и как условията се променят с течение на времето. Освен това трябва да се определи дали и по какъв начин екзогенната индукция на индуцируема хем оксигеназа (HO-1) влияе върху тези състояния. По-специално бяха изследвани функционалната капилярна плътност като параметър на хранителната ситуация при реперфузия и левкоцитно-ендотелното взаимодействие като параметър за ранната възпалителна реакция. За определяне на тези параметри е използван методът на интравитална епифлуоресцентна микроскопия. Влиянието на хем оксигеназата в нейната експресия и активност е проверено чрез молекулярна биология. Работата е разделена на следните раздели: 1. Ефекти от исхемия и реперфузия върху микроциркулацията на панкреаса без екзогенно влияние върху хем оксигеназата 2. Ефекти от индукцията на хем оксигеназа върху микроциркулацията на панкреаса при пост-исхемичен панкреатит
22 22 Фигура 5: Схематичен съдов ход на артериите на панкреаса (от HOFFMANN 70)
24 24 Япония) се намесва и датата и часът се показват и записват на екрана на монитора (WV-BM 1700, 41 см диагонал, Panasonic, Мюнхен). Чрез използване на споменатите по-горе лупи (микроскоп, CCD камера, монитор) е постигнато общо увеличение от около 680x. CCD ZG SVHS IVM TV Фигура 6: интравитална микроскопична експериментална настройка: Плъх с панкреас, прикрепен към далака под епифлуоресцентен микроскоп (IVM: интравитален микроскоп, CCD: камера с устройство за зареждане, ZG: таймер, SVHS: видео рекордер, телевизор: монитор) функционален Капилярна плътност Функционалната капилярна плътност е дължината [cm] на капилярите, перфузирани с червени кръвни клетки спрямо площта на зоната за наблюдение [cm²]. Капилярите, които не са перфузирани или са били перфузирани само с плазма, не са включени в оценката. За да се визуализира плазмата, 0,15 ml белязан говежди албумин, маркиран с флуоресцеин изотиоцианат (FITC-албумин, A-9771, 0,75%, Sigma-Aldrich Co, Deisenhofen, Германия), се инжектира интравенозно. След възбуждане от източника на светлина, флуорохром флуоресцеин изотиоцианат излъчва светлина с дължина на вълната nm, която чрез филтъра нагоре по веригата създава контрастен образ на микроциркулацията