Ролята на ендотелните прогениторни клетки при пациенти с аксиална спондилоартропатия - PDF
1 От Клиниката по нефрология и ревматология (проф. Д-р мед. Г.А. Мюлер) на Медицинския факултет на Университета в Гьотинген Ролята на ендотелните прогениторни клетки при пациенти с аксиална спондилоартропатия INAUGURAL DISSERTATION за получаване на докторска степен на Медицинския факултет на университета Георг Август zu Göttingen представено от Мария Елизабет Фогт, геб. Струве от Франкфурт на Одер Гьотинген 2018
2 декан: проф. Д-р обратно нат. H. K. Kroemer Лектор: Съ-лектор: Трети лектор: Priv.-Doz. Д-р мед. Сюзън Патшан проф. Д-р мед. Ротраут Мьоснер проф. Д-р мед. Margarete Schöm Дата на устния изпит: 12 юни 2019 г.
3 С настоящото заявявам, че съм подготвил дисертацията със заглавие Ролята на ендотелните прогениторни клетки при пациенти с аксиална спондилоартропатия и че не съм използвал други източници или помощни средства освен посочените от мен. Оснабрюк, The.
4 Съдържание на списъка с фигури. VI Списък на таблици. VII Списък на съкращенията. VIII 1. Въведение и цели Въведение Спондилоартрит и аксиална спондилоартропатия Дефиниция и история Епидемиология/ход на заболяването Патогенеза Клиника и курс Диагностика Физически преглед Резултати Критерии за класификация Образна лабораторна терапия/управление на AS Атеросклероза/сърдечно-съдов риск при пациенти с аксиларна ендотелна васкулогенеза и енгиогенеза Експериментално описание; Изолиране и култивиране на EPCs и различни цитокини Допълнителни стимуланти и инхибиращи фактори на EPC броя EPCs в контекста на патологичните състояния Състояние на изследването Материал и методи Събиране на данни от пациенти и събиране на данни Определяне на резултатите от EPC и методи за клинично изследване
5 3.4 Статистическа оценка на колективни резултати от пациенти Резултати от анализа на CFU Hill FACS анализ Вазомодулаторни медиатори Резюме на курса Дискусия Приложение Библиография V
7 Списък на таблици Таблица 1: Списък на използваните консумативи 38 Таблица 2: Обобщение на използваните инструменти/устройства 39 Таблица 3: Списък на използваните реагенти 39 Таблица 4: Описателна статистика на основните характеристики на колектива на пациента 46 Таблица 5: Клинични измервания за оценка на подвижността на гръбначния стълб/хода на заболяването 46 Таблица 6: Описателна статистика за броя на CFU-EC в групата пациенти и контролната група 47 Таблица 7: Списък на p-стойностите за броя на CFU-EC, класифицирани според различни променливи/характеристики 48 Таблица 8: Описателна статистика за броя на CFU-EC, класифицирани според пола 49 Таблица 9: Описателна статистика за броя на CFU-EC, класифицирани съгласно ASDAS 52 VII
8 Списък на съкращенията acldl = ацетилирана липопротеинова анкилоза с ниска плътност = цялостно втвърдяване на ставите AS = анкилозиращ спондилит = анкилозиращ спондилит ASAS = Оценка на спондилоартрит международно общество ASDAS = анкилозиращ спондилит заболяване Резултат активност axspa = къпане спондилоартрингерски бански ангилоза ангилоза ангилоза ангилоза ангилоза ангилоза ангилоза ангилоза Антилоза Антилоза Антилопа Функционален индекс BASG = Бански анкилозиращ спондилит Глобален резултат BASMI = Бански анкилозиращ спондилит Метрологичен индекс BSA = говежди серумен албумин BSG = скорост на утаяване на еритроцитите CAC = циркулираща ангиогенна клетка CD = клъстер на диференциация CEC = циркулираща ендотелна клетка, циркулиращи ендотелни клетки CED = възпалително заболяване на червата образуваща единица CFU-EC = образуваща колония единица-ендотелна клетка CPC = циркулираща прогениторна клетка CRP = C-реактивен протеин DMARD = модифициращо заболяването антиревматично лекарство ECFC = ендотелна колония-образуваща клетка ELISA = ензимно свързан имуносорбент nt Изследване Ентезит = възпаление в областта на прикачени сухожилия, връзки или капсули EC = ендотелни клетки ecfc = късни израстъци EPC EPC = ендотелна прогениторна клетка VIII
9 ESSG = Европейска изследователска група за спондилоартропатия FACS = активирано от флуоресценция сортиране на клетки FBA = разстояние от пръст до пода FLK-1 = VEGF рецептор-2 CD309 KDR HDL = липопротеин с висока плътност HLA = човешки левкоцитен антиген HSC = хематопоетични стволови клетки IL-6 = Interleukin-6 KDR = киназен инсертен домейн рецептор CHD = коронарна болест на сърцето LDL = липопротеин с ниска плътност LWS = лумбален гръбначен стълб MC = миелоидни стволови клетки MRT = ядрено-магнитен резонанс NO = азотен оксид NSAID = нестероидни противовъзпалителни лекарства физиологичен разтвор PDGF = тромбоцитен растежен фактор PPI = инхибитори на протонната помпа RA = ревматоиден артрит SDF-1 = стромен клетъчен фактор 1a SpA = спондилоартрит, спондилоартропатия, спондилоартропатия TGF = трансформиращ растежен фактор TPC = тъкан, пребиваващ прогениторна клетка IX VEGF = съдов ендотелен растежен фактор IX
11 Бяха изследвани следните въпроси: 1. Каква роля играят ЕРС при аксиалната спондилоартропатия? 2. Променили ли са се техният брой или функционалност в сравнение със здравата контролна група? 3. Броят или функцията на EPCs корелират ли с тежестта на клиничното протичане, използваната лекарствена терапия или активността на заболяването? 4. Играят ли роля EPC за прогресирането на заболяването при отделния пациент? Надяваме се, че резултатът от нашето проучване може да има ефект върху терапевтичните възможности или прогностичните параметри. 2
19 Значително неблагоприятни прогностични фактори според френско проучване са, освен коксит, ESR> 30, лош отговор на терапия с НСПВС, ограничена подвижност на лумбалния отдел на гръбначния стълб, ранно начало на заболяването (преди 17-годишна възраст), прояви на органи или олигоартрит (Puchner 2012). Консумацията на никотин и пренебрегването или само от време на време физиотерапията също имат отрицателен ефект върху курса. Смъртността е особено по-висока поради повишен сърдечно-съдов риск (Manger and Schulze-Koops 2012). 10
24 TNF-α блокери причиняват пълна ремисия при над 50% от пациентите с аксиална спондилоартропатия (Barkham et al. 2009). Всички измервания на напредъка (BASDAI, BASFI, BASMI) се подобряват след 24 и 102 седмици и параметрите на възпалението се нормализират (Braun and Sieper 2007). Според Haroon et al. (2013), терапията с TNF-α блокери, особено ако е започнала в ранен стадий на заболяването, изглежда намалява рентгенографския прогрес. Хирургичната терапия е опция само за избрани пациенти с физически увреждания, например с нестабилен гръбначен стълб. В допълнение към фармакологичната терапия фундаментална роля играят немедикаментозните мерки, особено физиотерапията. Проучванията показват, че когато редовно се извършва упражняваща терапия, може да се демонстрира подобрение на физическата функция, болката и цялостното благосъстояние (Dagfinrud et al. 2008). 15-ти
48 материали Устройство CO2 ИНКУБАТОР (отоплителен шкаф) Eppendorf пипети FACS-Calibur фризер хладилник Микроскоп: Дивертиране на обърнат микроскоп за клетъчни култури Olympus IX-81 стерилна пейка Чист въздух тип CA/R Vortex Genie 2 центрофуга: Megafuge 1.0R центрофуга: Rotixa/A производител Sanyo Eppendorf AG, Хамбург Becton Dickinson Sanyo Liebherr Leica Микросистеми Olympus Biohazard Bodo Schmidt GmbH Heraeus tools GmbH Hettich Таблица 2: Обобщение на използваните инструменти/устройства Вещество Каталожен номер на производителя Biocoll 1.0777 g/ml Biochrom AG, Belin L6115 BSA ph 7.0 LabClinics SA K Dcular AcLDL L3484 Endocult Basal Medium StemCell Technologies Inc. PE антитела Jackson Immunoresearch, Балтимор, САЩ Таблица 3: Списък на използваните реактиви 39
50 Finger-Floor Distance (FBA) Пациентът се навежда напред, доколкото може, с изправени крака. Измерва се разстоянието между върха на средния пръст и пода. Тази измерена стойност се използва за оценка на гръбначния стълб, както и тазобедрените стави и исхиокруралните мускули. Често се използва в клиниката за проследяване на напредъка (Feldtkeller и van der Heijde 2005). Страничен наклон на гръбначния стълб При изправен пациент се измерва разстоянието между пода и разширения връх на средния пръст по тялото. Прави се ново измерване с максимален страничен наклон, като краката все още са изправени (без въртене!). Средната стойност се формира от разликата между първата и втората стойност, измерена за двете страни (норма> 10 cm) и се използва за изчисляване на BASMI (van der Heijde et al. 2008). Фигура 10: Схематично представяне на страничен наклон на гръбначния стълб (за подробности относно измерването вижте текста) Разстояние на глезена Това измерване се използва за оценка на подвижността на тазобедрената става. При легнал пациент разстоянието между вътрешните глезени се измерва с възможно най-широки крака (изпънати колене, пръсти, насочени нагоре) (норма> 100 см). Тази стойност е включена в BASMI (Feldtkeller and van der Heijde 2005). 41
51 Разстояние на трагусната стена Това измерване се използва за оценка на кифозата. Разстоянието между трагуса и стената се измерва, като пациентът стои изправен с гръб и пети до стената и също е част от BASMI (Feldtkeller and van der Heijde 2005). Фигура 11: Схематично представяне на разстоянието от стената на трагуса (за подробности относно измерването, моля, вижте текста) Въртене на шийните прешлени Когато пациентът седи изправен и гледа право напред, главата се завърта надясно и наляво, доколкото е възможно (стандартно > 70). Ъгълът между максималното въртене и нулевата позиция се използва за изчисляване на BASMI. Раменете не трябва да се обръщат едновременно (Feldtkeller и van der Heijde 2005). BASMI Метрологичният индекс за анкилозиращ спондилит на ваната се формира от различни клинични измервания, за да се оцени подвижността на гръбначния стълб и всички ограничения. Те включват модифицираната мярка на Шобер, страничния наклон на лумбалния отдел на гръбначния стълб, максималното разстояние на глезена, разстоянието до стената на трагуса, въртенето на шийните прешлени (за изчисление вижте приложението) Този индекс е въведен в английския град Бат през 1994 г. През 42г
53 3.4 Статистическа оценка Резултатите бяха оценени с помощта на програмата STATISTICA от statsoft. Първо, данните бяха тествани за нормално разпределение с помощта на теста Shapiro-Wilks-W. Statistica използва разширение на този тест, описано от Royston 1992. Няма нормално разпределение в събраните данни. Освен това описателната статистика, особено със средната стойност и стандартното отклонение, е създадена с помощта на STATISTICA. Тъй като няма нормално разпределение, бяха използвани непараметрични методи за тестване на статистическата значимост. За това е използван U-тестът на Mann-Whitney. За разлика от нормалния t-тест с нормално разпределение, това не се основава на средните стойности, а на базата на ранговете. Значителна разлика, т.е. свръхслучайна асоциация, беше дефинирана с р-стойност под ниво на значимост от 0,05. За да се илюстрират връзките между различни променливи, коефициентът на корелация е изчислен с помощта на R на Spearman, както и нивото на значимост. За илюстриране на резултатите бяха създадени графики с кутии и разпръснати графики. 44
64 CFU-EC и пушене Има тенденция към по-малък брой CFU-EC при пушачите. Разликата при непушачите обаче не е статистически значима (p = 0,37). 70 Box-Whisker-Plot CFU и консумация на никотин Средна стойност на CFU + SD: консумация на никотин без консумация на никотин консумация на никотин без консумация на никотин средна стойност ± stdf. Средна стойност ± 1,96 * stdf. Извънредни крайни стойности Фигура 18: Брой CFU-EC, класифицирани според консумацията на никотин 55
65 4.3 FACS анализ За количествената оценка на cepcs, пробите на пациента бяха подготвени и анализирани с помощта на FACS устройство. Двойно положителните клетки за CD133 и FLK съответстват на cepcs. В сравнение със здравата контролна група тук не може да се види значителна разлика. Средната и средната стойност са почти идентични (p = 0,69, N пациенти = 49, N контролна група = 10). Също така не може да бъде показана статистически значима корелация между измерените CFU-EPC и CD133 +/FLK + клетките, измерени от FACS. 8 кутия с мустаци за двойно положителни CD133/FLK клетки пациенти и контролна група 7 6 CD133/FLK положителни клетки средна стойност + SD: пациенти - 0,97 + 1,65 контролна група - 0,75 + 0, пациенти контролна група средна стойност средна стойност ± Stdf. Средна стойност ± 1,96 * stdf. Извънредни екстремни стойности Фигура 19: cepcs (в%) при пациенти и контролна група. 56
66 FACS и активност на заболяването Разбивката на cepcs според активността на заболяването, измерена от BASDAI, показва статистически незначителна тенденция към по-голям брой cepcs с висока болестна активност (съответстваща на BASDAI> 4; p = 0,1). FACS и пол Класификацията на cepcs, измерена чрез FACS според пола, не показва значителна разлика (p = 0,08). Има тенденция към по-малък брой cepcs при пациенти от мъжки пол. 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 Box-Whisker-Plot Брой EPC (в%), разбити по пол EPC 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Средно + SD: Жени 1,45 + 2,3 мъже 0,62 + 0,8 0,4 жени мъже означават средно ± stdf. Средна стойност ± 1,96 * stdf. Фигура 20: cepcs (в%), класифицирани според пола 4.4 Вазомодулаторни медиатори Разликите между концентрациите на различните вазомодулаторни медиатори (VEGF, PDGF, TGF-β, ангиопоетин -1 и -2) в контролната група и при пациентите не са статистически значими. 57