Разпознаване на ензим-субстрат в реакции на сгъване на катализиран протеин - PDF безплатно изтегляне
Разпознаване на ензим-субстрат в катализирани реакции на сгъване на протеини
Разпознаване на ензим-субстрат в катализирани реакции на сгъване на протеини Дисертация за получаване на академична степен rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Представена на Факултета по естествени науки I Biosciences в университета Мартин Лутър Хале-Витенберг от дипломиран химик Каролайн Хаупт, родена на 28 юни 1980 г. в Karlsburg Halle (Saale) 2009 г.
Докторска заявка подадена на: 8 октомври 2009 г. Ден на научния колоквиум: 21 декември 2009 г. Рецензент: (1) проф. Д-р Милтън Т. Стъбс (2) Проф. Д-р. Йохен Балбах (3) PD Dr. Йохен Райнщайн
Истинският учен се вслушва в интелигентността на природата и вижда същността на нещата. Антъни Г. Е. Блейк
Съдържание 3.2.3. Обобщаваща дискусия: локализация на местата за свързване в SlyD * и характеризиране на активността на шаперона. 103 3.3. Пептидил пролил изомеразна функция на SlyD *. 105 3.3.1. Значение на мутацията Y68W за каталитичния механизъм на пролил изомеразата SlyD *. 105 3.3.2. ЯМР проучване в реално време за катализиране на повторното нагъване на RNase T1 (S54G/P55N). 107 3.3.2.1. 3D NMR спектроскопия за определяне на кинетичното сгъваемо междинно съединение на RNase T1 (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. ЯМР спектроскопичното откритие на втора конформация в естествена RNase T1 (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Наблюдение на повторното нагъване на катализа чрез серийно записани 2D 1 H/15 N-TROSY-HSQC спектри. 113 3.3.3. Обобщаваща дискусия: Наблюдение в ЯМР в реално време на катализираното повторно сгъване на SlyD * на преходното сгъваемо междинно съединение на RNase T1 (S54G/P55N). 119 4. Резюме. 121 5. Обобщение. 123 6. Списък на съкращенията. 125 7. Библиография. 129 8. Приложение. 143 8.1. Илюстрации. 143 8.2. Маси. 159 8.3. Пулсови програми. 175 8.4. Макроси на Феликс. 191 9. Собствени публикации. 193 10. CV. 194 11. Благодарности. 195 III
Температурата на въвеждане и каталитичните условия са оптимизирани. Освен това за този въпрос е необходимо разработването и адаптирането на ЯМР методите в реално време, които да се използват. Следователно целта на настоящата работа трябва да бъде молекулярното разбиране на катализа на реакциите на бавно сгъване от PPIases, както и доменната комуникация между chaperone и PPIase домейните на SlyD *. 19-ти
Записано измерение на материали и методи. Продължителността на FHSQC спектър е 4 минути 52 s. Оценката на спектрите беше извършена аналогично на NMR титруванията и анализът на химичното изместване с помощта на уравнение [2.14]. 59
Резултатите и дискусията са отбелязани. Обемът на кръстосаните сигнали се използва за оценка на прехода за развитие. Намаляване на обема се наблюдава за кръстосаните пикове на местните видове и увеличаване на обема за сигналите на денатурираните видове с различно химично изместване. Общо 93 аминокиселинни остатъка могат да бъдат оценени за естественото състояние (приложение, табл. 8-1). Фиг. 3-6 1 H/15 N TROSY спектри на SlyD * по време на разгъване, индуцирано от урея. Спектър на SlyD * в естествено състояние при 0 M урея, B в разгънато състояние при 5,5 M урея и C в преходния център при 2,2 M урея. Преходът се измерва в 50 mm Na2 HPO 4, 100 mm NaCl, 10% D20, рН 7,5 при 15 ° С и концентрация на протеин 0,67 mm. Съответната крива на преход за зададените кръстосани сигнали е показана на фиг. 3-7. Някои примери за кръстосани пикове, показващи крива на преход съгласно модела на две състояния, са показани на фиг. 3-7. Остатъци, чиито напречни пикове са били 68
Резултати и дискусия A B Фиг. 3-14 H/D обмен на SlyD *. A Защитни фактори на гръбначните амидни протони на SlyD * в логаритмичен график. Правоъгълниците представляват вторични структурни елементи, запълнените правоъгълници означават β-листове, отворени за α-спирали. B Области с високи (S> 10 4, синьо) и ниски защитни фактори (10 2 S 10 4, циан), поставени върху структурата на SlyD *. Защитните фактори бяха изчислени съгласно уравнение [2.26]. Областите, в които съответните кръстосани сигнали са се обменяли в рамките на мъртвото време на експеримента (40 минути), са показани в сиво. Неразпределените остатъци и пролините са оцветени в черно. Амиден протонен обмен за определяне на реакции на бърз обмен С модифицираната техника MEXICO (New MEXICO, 2.7.6.) Процесите на обмен могат да се определят за времеви интервал от 10 ms до 250 ms. За 47 амидни протона, чийто обмен с протони на разтворители не може да бъде открит с H/D обмен поради по-ниската защита, по-високи обменни курсове бяха анализирани с New MEXICO в посочения времеви прозорец. Фиг. 3-15D показва възстановяването на намагнитването на амидните протони чрез обмен на поляризирани водни протони.
Резултати и дискусия Фиг. 3-15 Бърза амидна протонна обмяна (Нова МЕКСИКА). A-C 1 H/15 N-FHSQC спектри преди амидния протонен обмен (референтен) и 60 ms или 250 ms след началото на обменната реакция. D Кинетика на обмен за избрани аминокиселинни остатъци на SlyD * при pH 7,5 и 15 C. Адаптирането на кинетиката към моно-експоненциална функция доведе до обменни курсове от 512 ± 5 s -1 (R95), 37 ± 3 s -1 (G86), 14 ± 2 s -1 (S40) и 12 ± 2 s -1 (Q102). Посочените грешки са резултат от адаптацията към моноекспоненциална функция. Оценка на обменните реакции по отношение на термодинамичната стабилност може да се извърши само ако процесът на обмен протича съгласно механизма EX2 (2.7.6). Поради зависимостта от рН на принадлежността към механизма EX1 или EX2, експериментът New MEXICO беше повторен с две други стойности на pH (pH 6.0, pH 9.0). Може да се наблюдава преход към диапазона EX1 за 20 остатъка при висока стойност на ph. Те са пропуснати за термодинамично съображение. За останалите 27 аминокиселинни остатъка, защитните фактори и термодинамичната стабилност бяха изчислени съгласно уравнение [2.26] (Приложение, табл. 8-8). 79
7,0 kj/(m mol). Наличието на IF домейн означава за SlyD * в сравнение с изолирания FKBP домейн (SlyD * - IF, G U (H 2 O)
4.7 kj/(m mol)) огромен прираст в стабилността и значително повишена кооперативност. Това също обяснява съгласуваното развитие на двата домейна. SlyD * се развива като кооперативна сгъваема единица, в която нито един от двата домейна не може да бъде локално разгънат, когато другият е сгънат. С помощта на теорията за водородния обмен на естественото състояние може също да се покаже, че FKBP се разгръща като единица с IF домейна, тъй като не могат да бъдат открити частично сгънати междинни състояния или сгъваеми субединици. Значителна термодинамична стабилизация на SlyD (1-155) настъпва в присъствието на Ni 2+. В сравнение с кристалната структура на TtSlyD (Löw et al., 2009), мястото на свързване на металния йон може да бъде локализирано. Той се намира в последната α-спирала (α3) на FKBP домейна в хистидинов мотив: His149-Gly150-His151-Val152-His153 в E.c.SlyD или His145-Gly146-His147-Ala148-His149 в TtSlyD. Тази последна α-спирала е уникална сред FK506-свързващите протеини и се среща само в FKBP, които са хомоложни на SlyD. По този начин той не само представлява нов структурен, но и нов функционален елемент
Списък на съкращенията 6. Списък на съкращенията 1D, 2D, 3D, едно-, дву-, триизмерни A 280 nm AcCN Amp A.U. а.у. bp BEST BSA или c CD CsA C p δ MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o DNA DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID FKBP абсорбция при 280 nm ацетонитрил ампицилин абсорбционни единици произволни единици основа двойка (ДНК) лента селективно възбуждане краткотрайно говежди серумен албумин (говежди серумен албумин) или концентрация кръгов дихроизъм Циклоспорин Промяна в топлинния капацитет (изобарен процес) означава промяна в химична смяна без стабилизиране енталпия при отсъствие на денатурант van t Hoff енталпия промяна в ентропията по време на разгъване разлика в показателите на пречупване дебелина на слоя на кюветата (в dm) децентрация на концентрацията на денатурант в денатурираща разгъната двойно дейонизирана вода (остатъчна проводимост 0.055µSithiothreitolic acid) ) моларен коефициент на екстинкция активираща енергия Ешерихия коли етилендиаминтетраацетат електроспрей йонизация без индукция разпад FK505 свързващ протеин 125
Списък на съкращенията FT GdmCl HCl HMQC hnoe HSQC Hz (MHz, GHz) АКО INEPT IPTG ITC k 0 k cat k cat/KM k ch k cl KDK eq k int k kat KK KM k op N n NaOH NMR NOE NOESY M m (Ново) МЕКСИКА мин. Мин. Фуриева трансформация гуанидиниев хлорид солна киселина хетероядрена множествена квантова кохерентност хетероядрена NOE ефект хетероядрена единична квантова кохерентност Hertz (s -1) (Megahertz, Gigahertz) подобряване на чувствителните ядра чрез внасяне в клапи чрез трансфер на поляризация изопропил-β-D-реакция тикалогаламапипирация обратна реакция титалогаламапипирация обратна реакция титалогаламапипирация титралог Скорост на каталитична ефективност на ензимен химичен обмен, скорост на затваряне, дисоциационна константа, равновесие, постоянна вътрешна скорост на обмен (определена за моделни пептиди), скорост на катализираната реакция за повторно нагъване, хидрофобен пептид от HiPIP сигнална пептидна последователност с два лизина вместо аргинин, Michaelis-Menten, постоянна скорост на отваряне, естествено състояние, ядрено-магнитен резонанс, стехиометрия натриев хидроксид Подобряване Nuclear Overhauser Подобрение спектроскопия Моларен (mol/l) измерване на параметрите на кооперативност на бързи скорости на обмен на протони в изотопно маркирани compou nds минута поне 126
Списък на съкращенията MS Ni-IMAC OD P PCR PPIase ppm RCM-T1 RCM-α-La RNase T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U и др. Обороти и т.н. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP масспектрометрия Ni-йон метал афинитетна хроматография защитен фактор на оптична плътност полимеразна верижна реакция пептидил-пролил-цис/транс-изомераза части на милион редуцирани и карбоксиметилирани RNase T1 редуцирани и карбоксиметилирани α-лакталбумин рибонуклептид T1 хидрофобни IP1 Сигнална пептидна последователност втора Натриев додецил сулфат полиакриламиден гел електрофореза чувствителност към лизис D EcSlyD (1-165) лентово-селективен оптимизиран флип-ъгъл краткотраен малък подобен на убиквитин модификатор температура в преходния център двойно-аргинин транслокон сигнална пептидна последователност от CueO N, N, N, N -Тетраметилдиамин Трифлуороцетна киселина Трифлуоретанол обща корелационна спектроскопия време пропорционално нарастване на фазата Трис- (хидроксиметил) аминометан напречна релаксация оптимизирана спектроскопия в разгънато състояние, включително обороти в минута, вероятно ултравиолетов хидрофилен пептид от HiPIP сигнален пептиден обем на обем ват потискане чрез градиентно-оцветено възбуждане, прекрасен богат на хистидин протеин 127
Списък на съкращенията (w/v) YpSlyD напр. Тегло на обем SlyD от Yersinia pestis например аминокиселини бяха съкратени с обичайните кодове с една или три букви. 128
Приложение 8. Приложение 8.1. Фигури Фиг. 8-1 Флуоресцентен емисионен спектър от 5 µm SlyD * в 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 15 С. Възбуждането се извършва при 278 nm. Плътната линия представлява естественото състояние, кривата за разгънатото състояние Протеинът е показан с пунктирани линии. Фиг. 8-2 Индуциран от урея разгъващ се преход на SlyD * -F84W. Откриване на прехода при 308 nm след възбуждане при 280 nm (триъгълници), откриване при 344 nm след възбуждане при 295 nm (кръгове). Плътните линии представляват адаптирането на данните към модела с две състояния. Получените параметри на стабилност са (след възбуждане при 280 nm): GU (H 2 O) = 16,8 ± 0,7 kj/mol, m eq = 6,8 ± 0,3 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,5 M. Вторият преход, който е показан увеличен в B, не може да бъде оценен. Плътната линия е само за по-лесно гледане. Преходът се измерва в 50 mm Na2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 15 С. Концентрацията на протеин е 5 цт. 143
Приложение Фиг. 8-3 Индуциран от урея преход на развитие от SlyD * - IF. Разгъващ се преход от SlyD * (отворени символи) и SlyD * - IF (затворени символи). Плътните линии представляват адаптирането на данните към модела с две състояния. Получените параметри на стабилност са за SlyD *: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 kj/mol, m eq = 6,9 ± 0,2 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2.7 M и за SlyD * - IF: GU (H 2 O) = 13.9 ± 0.5 kj/mol, m eq = 3.2 ± 0, 1 kj/(m mol), [D] 1/2 = 4.3 M Преходите са измерени в 50 mm Na2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 15 С. Концентрацията на протеин е 5 цт. Фиг. 8-4 Данни за изотермична титрационна калориметрия на два хомоложни SlyDs с Ni 2+. Интегрираното количество топлина се начертава спрямо съотношението концентрация на лиганд/протеин. Във всеки случай могат да се видят две събития на свързване, но не беше възможно да се адаптират данните към съответния модел на обвързване поради взаимосвързаните процеси. Изотермично титруване на 18 µm TtSlyD-His 6 с 270 µm NiCl2 (в 10 mm Tris, pH 25 C 7.5, 25 C). B Изотермично титруване на 16 µm E.c. SlyD (1-165) -His 6 с 240 µm NiCl 2. 144
Приложение Фиг. 8-5 Криви на изотермична титрационна калориметрия на TtSlyD с Co 2+, Gd 3+ и Zn 2+. Горната фигура показва електрическата мощност, която се открива след всяко инжектиране на съответния метален йон. На фигурата по-долу интегрираните количества топлина са нанесени спрямо съотношението на концентрация на метални йони/TtSlyD. Термодинамичните параметри са получени от нелинейно приспособяване към експерименталните данни на свързващ модел с място на свързване. Изотермично титруване на 27 µm TtSlyD с 270 µm CoCl2 (в 10 mm Tris, рН 25 C 7.5, 25 C). Енталпията на реакцията, освободена чрез свързване, е -13,2 ± 0,2 kcal/mol; константата на афинитета е 2,4 ± 0,2 х 106 М -1. Това доведе до K D стойност от 420 nm. Данните, показани в червено, съответстват на титруването на TtSlyD с GdCl 3. Не може да се определи свързване на Gd 3+. B Изотермично титруване на 27 µm TtSlyD с 270 µm ZnCl2 (в 10 mm Tris, рН 25 C 7.5, 25 C). Енталпията на реакцията, освободена чрез свързване, е тук -10,0 ± 0,1 kcal/mol; афинитетната константа е 9,8 ± 1,5 х 106 М-1. Получената стойност на K D е 102 nm.145
Приложение Фиг. 8-6 ЯМР титруване на 15 N-SlyD * с естествена RNase T1 (S54G/P55N) в 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 25 С. Промяната в химичното изместване на някои напречни пикове се основава върху неспецифични взаимодействия на неструктурираната С-терминална част и тагът His 6. Фиг. 8-7 Детекция на флуоресценция на Tat27 със SlyD * в 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 25 С. Плътната линия съответства на адаптацията към прост модел на свързване с едно място на свързване. Стехиометрията на 1 води до константа на дисоциация от 0,5 ± 0,1 µm. Аминокиселинна последователност на Tat пептида: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146
Приложение Фиг. 8-8 Титруване на 15 N-SlyD * с RCM-T1. Зависимост на промяната в химичното изместване от съотношението на концентрацията RCM-T1 към SlyD * (A) и от концентрацията на субстрата RCM-T1 (B) за двата амидни протона на D88 и S26 от NMR титруването. A Кривата на равновесно свързване се получава от линейното прилягане. Точката на еквивалентност е около 1 и показва комплекс 1: 1. B Плътните линии са предназначени само за насочване на окото, но нямат физическо значение. C Титриране на RCM-T1, открито с флуоресценция, със SlyD *. Плътната линия съответства на адаптацията към прост модел на свързване с точка на свързване. Стехиометрията на 1 води до константа на дисоциация от 4,4 ± 0,8 µm. И двете титрувания се провеждат в 50 mm Na2 HPO 4, 100 mm NaCl, рН 7,5 при 25 ° С. 147
Приложение Фиг. 8-9 1 H/15 N-FHSQC спектър на изолирания IF домейн в присъствието на 0,5 M (NH 4) 2 SO 4 при 25 С. Кръстосаните пикове на разгънатия вид се намират главно в средата на Спектър при 7,8 до 8,4 ppm. Интензивността на дисперсните сигнали на структурираните видове е приблизително 30%. Фигура 8-10 Последователност на 1D 1Н спектри от 450 µm инсулин след началото на агрегационната реакция при 25 ° С чрез добавяне на DTT. Показана е зоната с ниско поле с няколко сигнала от амидни протони на верига А. 148
Приложение Фиг. 8-13 1 H/15 N-хетероядрен NOE при 14,2 T и 25 C за SlyD * (черен) и SlyD * -Y68W (червен). Различната динамика на двата домена в двата протеина може ясно да се види на времевата скала на пикобис наносекунда NMR; IF домейнът е много по-гъвкав от домена FKBP. В района около W68 мутантът показва повишена динамика. Данните за hnoes бяха любезно предоставени от Michael Kovermann. Фиг. 8-14 Термодинамична стабилност на SlyD * срещу GdmCl. Индуциран от GdmCl преход на SlyD * в 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 при 20 C (A) и в 10 mm Bis-Tris, ph 10 C 6,0 при 10 C (B). Плътните линии представляват адаптирането на данните към модела с две състояния със следните параметри на стабилност: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 kj/mol, m eq = 13,7 ± 1,1 kj/(m mol) и [D] 1/2 = 1,1 M (ph 7,5, A) или GU (H 2 O) = 12,0 ± 0,8 kj/mol, m eq = 13,0 ± 0,6 kj/(m mol) и [D] 1/2 = 0.9 M (ph 6.0, B). Концентрацията на протеин е 2 µm (A) и 5 µm (B). Грешките са резултат от напасването на данните в уравнение [2.10]. 150
Приложение 10 9 8 7 6 5 1 H (ppm) Фиг. 8-15 1 H спектри на SlyD * в 10 mm Tris, ph 20 C 7.5 в присъствието на GdmCl. Ниската разделителна способност и интензивността на сигнала в присъствието на GdmCl (0,4 M GdmCl (червен спектър) и без GdmCl (син спектър)) могат да бъдат ясно видими. 151
Приложение Фиг. 8-16 подредени парцели за повторно сгъване на RNase T1 (S54G/P55N). Последователност на 1D 1H спектри от 1,9 mm RNase T1 (S54G/P55N) в отсъствие (A) и присъствие на 190 µm SlyD * (B). Показана е нискополевата област с амидната протонна област. Времевата разделителна способност за спектър беше 5 минути 21 s, тъй като бяха усреднени четири последователни спектъра, за да се подобри съотношението сигнал/шум. 152