ОТКРИВАНЕ С ХОРИЗОНТАЛНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА За правилна оценка на резултатите от PCR е важно да се

За правилна оценка на резултатите от PCR е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла.

Метод на хоризонтална електрофореза

откриване

Използват се различни методи за визуализиране на резултатите от усилването. Днес най-разпространен е методът на електрофореза, основан на разделянето на ДНК молекулите по размер (Фигура 22). За целта се приготвя плака с агарозен гел, която се замразява след топене в електрофорезен буфер агароза в концентрация 1,5-2,5% с добавяне на специално ДНК багрило, например етидиев бромид. Замразената агароза образува пространствена решетка. При пълнене с гребени в гела се образуват специални кладенци, в които впоследствие се въвеждат амплифициращи продукти. Гелевата пластина се поставя в хоризонтален апарат за електрофореза с гел и се свързва източник с постоянно напрежение. Отрицателно заредената ДНК започва да се движи в гела от минус към плюс. В този случай по-късите ДНК молекули се движат по-бързо от дългите. Скоростта на движение на ДНК в гела се влияе от концентрацията на агароза, силата на електрическото поле, температурата, състава на буфера за електрофореза и, в по-малка степен, GC състава на ДНК. Всички молекули с еднакъв размер се движат с еднаква скорост. Багрилото е вградено (интеркалирано) в равнинни групи в ДНК молекули. След края на електрофорезата, с продължителност от 10 минути до 1 час, гелът се поставя върху филтъра на трансилуминатор, излъчващ светлина в ултравиолетовия диапазон (254, 310 nm). UV енергията, погълната от ДНК в областта от 260 nm, се прехвърля върху багрилото, което води до флуоресценция в оранжево-червения видим спектър (590 nm).