От медицинската университетска клиника
1 От Медицинска университетска клиника, Катедра по вътрешни болести ΙΙΙ на Университета Алберт Лудвиг във Фрайбург i. Бр. Ролята на TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N за получаване на медицинска степен на медицинския факултет на Университета Алберт-Лудвигс Фрайбург i. Представен през 2010 г. от роден в Peter Stachon Göppingen
2 декан: проф. Д-р Д-р h.c. мулти. Hubert Erich Blum 1-ви рецензент: PD Dr. Андреас Зирлик 2-ри рецензент: PD Dr. Майкъл Хофман Година на доктора: 2011
4 Съдържание TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза Генотипизиране на мишки: ДНК изолация Генотипизиране на мишки: Полимеразна верижна реакция (PCR) Трансплантация на фетални чернодробни клетки при мишки Процес на трансплантация на фетални чернодробни клетки Генериране на донорни стволови клетки Генотипиране на донори: Qiagen-kit Миелоаблативно облъчване и трансплантация Трансплантация на фетални чернодробни стволови клетки при CD45.1 мишки Оцветяване за оцветяване на съдържанието на мазнини в артериалната стена Имунохистохимично оцветяване MAC-3 за макрофаги в артериалната стена Имунохистохимично оцветяване на CD4 + T помощни клетки Имунохистохимично оцветяване на гладки мускулни клетки на K Колаген: Picrosirius Червено оцветяване Оценка Снимане на секциите Оценка на аортния корен Оценка на аортните дъги и коремната аорта. 42
8 Въведение TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза Фиг. 1: В Европа сърдечно-съдовите заболявания са най-честата причина за смърт И мъжете (отгоре) и жените (отдолу) заболяванията на сърдечно-съдовата система са най-честата причина за смърт. Повечето от тези заболявания са патофизиологично базирани на атеросклероза. Източник:
52 Резултати от TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза След четириседмична фаза на разтваряне се взема кръв от мишки и това се оценява с помощта на FACS за възстановяване на CD45.1 чрез двойно оцветяване с CD45.1-APC и CD45.2-PE. Този експеримент показва успешно възстановяване: 95,2% и 95,0% от кръвните клетки са заменени от стволовите клетки, получени от фетален черен дроб. Освен това е показано, че CD19-положителни В-лимфоцити, CD3-положителни Т-лимфоцити и CD11b-положителни левкоцити като моноцити, макрофаги, гранулоцити и естествени клетки-убийци носят CD45.1 маркера на повърхността след трансплантация на фетални чернодробни клетки. Ако някой анализира по-отблизо тези подгрупи, вижда, че CD11b и CD19 положителните клетки са заменени от донорните клетки до повече от 99%. Само в групата на Т-клетките има около 4% от клетките-реципиенти, които най-вероятно са Т-клетки на паметта (Фиг. 7).
53 Резултати TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза Фиг. 7: Успешно възстановяване на периферни кръвни клетки чрез трансплантация на фетални чернодробни клетки LDLR -/- мишки (CD45.2 положителни/cd45.1 отрицателни, A) бяха облъчени миелоаблативно (2x450cGy) и с фетални чернодробни клетки от дни стари плодове (CD45.2 отрицателни, CD45.1 положителни, B) възстановени. 4 седмици по-късно на мишките е направена кръв и е извършен FACS анализ на трансплантираните животни за повърхностните маркери CD45.1 и CD45.2 (например С.
59 резултата TRAF2 +/+/LDLR -/-: mm2, 0,53 ± 0,18 +/+ контролна група (TRAF2/LDLR Също TRAF2- стволови клетки, хетерозиготно възстановени TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза -/- N = 13, p = +/+ 0,56) в сравнение с -/- до 2 в TRAF2/LDLR: 0,41 ± 0,08 mm, N = 16). Получатели с дефицит на TRAF2 с подобен размер на атеросклеротични лезии (TRAF2 -/-/LDLR -/- в TRAF2 +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 mm2, N = 17, p = 0,60, фиг. 12). В допълнение към размера на атеросклеротичната лезия, неговият състав също представлява голям интерес, тъй като влияе върху стабилността на плаката. Ако делът на липидите в плаката се увеличи, това е свързано с повишена честота на разкъсване на плаката при хората. Дефицитът на TRAF2 обаче няма влияние върху съдържанието на липиди в атеросклеротичните лезии (Фиг. 12). B 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/-/LDLR -/- Маслено червено-О положително оцветяване/размер на лезията на цялата стена на съда (mm 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/в TRAF2 +/-/LDLR -/- Фиг. 12: Дефицитът на TRAF2 не влияе нито върху Размерът все още влияе върху съдържанието на липиди в атеросклеротичните лезии
66 Резултати TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза TRAF6 не променя състава на атеросклеротичните лезии.След това беше проверена хипотезата дали TRAF6 има влияние върху състава на атеросклеротичните лезии. При хората това има последици за стабилността и следователно за податливостта на атеросклеротична лезия да се разкъса. Следователно, според диетата, бяха изготвени хистологични срезове, оцветени за макрофаги (фиг. 17А), за липиди (фиг. 17Б), гладкомускулни клетки (фиг. 17С), колаген (фиг. 17D) и Т клетки (фиг. 17Е) бяха. Оказва се, че дефицитът на TRAF6 няма влияние върху състава на атеросклеротичната лезия, тъй като не е установена значителна разлика между трите групи в нито едно от извършените оцветявания.
67 Резултати TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза A Mac-3 положителна зона (%) p = 0,23 p = 0,52 B Маслено червено-O положителна област (%) p = 0,58 p = 0,98 C α- актин положителна зона (%) p = 0,95 p = 0,16 D picrosirius redpositive area (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 CD4 + клетки/стена на съда p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- в TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- в TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- в TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 Фиг. 17: Дефицитът на TRAF6 променя плаката Състав, който не е облъчен миелоаблативно TRAF6 +/+/LDLR -/- мишки са получили или TRAF6 +/+/LDLR -/- (бели стълбове, N = 21) или TRAF6 -/-/LDLR -/- стволови клетки (излюпени решетки, N = 21). TRAF6 +/-/LDLR -/- мишките бяха възстановени с TRAF6 -/-/LDLR -/- стволови клетки (черни стълбове, N = 22). След това всички групи получават богата на холестерол диета в продължение на 18 седмици, в края на която съставът на атеросклеротичните лезии в областта на аортните корени се определя количествено чрез имунохистохимично оцветяване. Резултатите за макрофаги (A), липиди (B), гладкомускулни клетки (C), колаген (D) и Т клетки (E) се събират и показват като средно ± SEM.
68 Резултати TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза TRAF6 няма влияние върху атерогенезата в низходящата аорта и в аортната дъга Тъй като атеросклерозата може да се развива по различен начин в различни точки на съдовата система, низходящата аорта до бифуркацията е анализирана в едно лице след оцветяване на липиди, изследвани с помощта на Oil-Red-O. Както се очакваше, нямаше разлики в коремната аорта между животни с дефицит на TRAF6 (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) или TRAF6-компетентни (20,5 ± 2, 6%, N = 8) са трансплантирани стволови клетки. TRAF6 +/-/LDLR -/- реципиенти, които са получили хемопоетични стволови клетки с дефицит на TRAF6 (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23) също имат подобно липидно разпределение като контролната група (Фиг. 18А и Б). Дори в хистологично анализираните аортни дъги, животните, трансплантирани със стволови клетки с дефицит на TRAF6, имат размери на плаките, подобни на тези в контролната група (TRAF6 -/-/LDLR -/- при TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 mm 2, N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- в TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006 mm 2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- в TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 mm 2, N = 20, фиг. 18 C и D).
69 Резултати TRAF2 и TRAF6 при атеросклероза Фиг. 18: Дефицитът на TRAF6 променя липидното разпределение в коремната аорта и размера на атеросклеротичните лезии в аортната дъга, а не миелоаблативно облъчени TRAF6 +/+/LDLR -/- мишки получават или TRAF6 +/+/LDLR -/- (бели ленти, N = 8) или TRAF6 -/-/LDLR -/- стволови клетки (излюпени ленти, N = 8). TRAF6 +/-/LDLR -/- мишките бяха възстановени с TRAF6 -/-/LDLR -/- стволови клетки (черни ленти, N = 10). След това всички групи получиха диета с висок холестерол в продължение на 18 седмици, в края на която беше анализирана атеросклерозата в коремната аорта след оцветяване с Oil-Red-o срещу липиди по лицето. Обединените резултати са дадени като Oil-Red-O за обща площ ± SEM (A), представителните аорти се снимат без увеличение в долния ред (B). След диетата се правят хистологични разрези на аортните дъги и се оцветяват с Oil-Red-O. Обединените размери на атеросклеротичните лезии ± SEM са показани в горния ред (C), по-долу са представителни хистологични сечения, оцветени с маслено червено - O при 4-кратно увеличение (D).