Модел на човешка 3D извънклетъчна матрица-адипоцитна култура за изследване на матрично-клетъчен метаболизъм

Обобщение

Ние описваме триизмерна адипоцитна система за матрица човек-човек in vitro, която позволява ролите на матрицата и адипоцитите да бъдат разделени при кодифициране на метаболитния фенотип на мастната тъкан.

Резюме

Въведение

Извънклетъчният матрикс (ECM) не само осигурява механична рамка за тъканите, но също така се намесва в сложен кръстосан разговор с клетките, които се намират в него и регулира различни процеси, необходими за тъканната хомеостаза, включително клетъчна пролиферация, диференциация, Сигнализиране и метаболизъм 1. Докато здравият ECM играе съществена роля за поддържането на нормалната тъканна функция, дисфункционалният ECM е замесен в няколко заболявания 2 .

Мастната тъкан играе важна роля в патогенезата на метаболитните заболявания. Затлъстяването се свързва с прекомерна адипоцитна хипертрофия и клетъчна хипоксия, дефекти в метаболизма на адипоцитните клетки и мастната тъкан, повече ендоплазмен ретикулум и оксидативен стрес и възпаление. Въпреки че са слабо разбрани, тези сложни процеси се компилират, за да компрометират буферния капацитет на мастната тъкан, което води до преливане на хранителни вещества от мастната тъкан, токсичност на много тъкани и системно метаболитно заболяване 3, 4, 5. Последователността от събития и специфични механизми, лежащи в основата на недостатъчност на мастната тъкан, са слабо разбрани, но са включени промени в ECM на мастната тъкан. Съставът на ECM се променя в мастната тъкан при затлъстяване при хора и мишки, с повишено отлагане на ECM протеин, заедно с качествени биохимични и структурни разлики в ECM на мастната тъкан, свързани с човешки метаболитни заболявания, включително диабет тип 2 и хиперлипидемия 6, 7, 8, 9, 10, 11 .

Въпреки тези наблюдения, ролята на ECM на мастната тъкан в медиирането на дисфункцията на мастната тъкан не е добре дефинирана. Това отчасти се дължи на липсата на стабилни експериментални модели, които позволяват разлагане на специфичните роли на ECM и адипоцитите при регулирането на крайната мастна функция. ECM културата на адипоцитите симулира in vivo средата на естествената мастна тъкан най-малко в две точки. Първо, ECM културата осигурява молекулярна среда, подобна на естествената мастна тъкан, включително естествени колагени, еластини и други матрични протеини, които липсват в стандартната 2D култура. На второ място, беше показано, че културата върху 2D пластмаса променя метаболизма на адипоцитите чрез механични ефекти поради намалената еластичност на пластмасовия субстрат 12, което елиминира ECM културата.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Затлъстелите тъкани се набавят от хора, подложени на избирателна бариатрична хирургия под одобрението на институционалния преглед.

1. Изолиране на преадипоцити и приготвяне на реагент за култивиране

  1. Пригответе 2% говежди серумен албумин (BSA) в 1x фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Стерилизирайте филтъра и съхранявайте при 4 ° C.
  2. Пригответе колаген тип II за нос: 2 mg/ml в 2% BSA в 1x PBS. Пригответе непосредствено преди употреба.
  3. Пригответе разтвор за лизисване на червените кръвни клетки (RBC): 1,5 М NH4Cl, 100 тМ NaHCO3, 10 тМ динатриев EDTA в дейонизирана вода (DI/H2O). Съхранявайте при 4 ° C. Пригответе 1x разтвор за лизис на еритроцити от 10 пъти разтвор за съхранение в DI/H2O непосредствено преди употреба.
  4. Пригответе растежна среда: 15% фетален говежди серум (FBS), 1% противогъбичен разтвор (ABAM) в модифицирана среда на Dulbecco Eagle: хранителна смес F-12 (DMEM/F12). Стерилизирайте филтъра и съхранявайте при 4 ° C.
  5. Пригответе разтвор за замразяване на преадипоцити: 10% диметил сулфоксид, 15% FBS в DMEM/F12 среда. Стерилизирайте филтъра и съхранявайте при 4 ° C.
  6. Приготвяне на диференцираща среда: 10 mg/L трансферин, 33 'M биотин, 0,5' M разтвор на човешки инсулин, 17 'M D-пантотенова киселина хемициева сол, 100 nM дексаметазон, 2 nM 3,3', 5-трийод-L-тиронин натриева сол (Т3), 1 изобутил-1-метилксантин (IBMX), 1% ABAM в DMEM/F12. Стерилизирайте филтъра и съхранявайте при 4 ° C.

3. Приготвяне на метаболитен фенотип за реагент

  1. Поглъщане на глюкоза
    1. Пригответе серумна среда за гладуване: DMEM/F12, 1% ABAM. Стерилизирайте филтъра и съхранявайте при 4 ° C
    2. Пригответе 200 nM разтвор на човешки инсулин в 1x PBS непосредствено преди употреба.
    3. Пригответе 200 пМ човешки инсулин, 0,1 тМ 2-дезокси-D-глюкоза, 1 Ci/гнездо дезокси-D-глюкоза, 2- [1,2-3 Н (N)] -, в 1x PBS. Пригответе непосредствено преди употреба.
  2. Липолиза
    1. Пригответе изопротеренол, разреден в PBS: 3 mM основен разтвор. За анализа се разрежда работна концентрация от 3 m.
  3. Маслено червено-O оцветяване
    1. Пригответе 4% формалин в DI/H2O. При стайна температура.
    2. Пригответе работен разтвор Oil Red-O. Разредете разтвора Red-O (ORO) с DI/H2O в съотношение 3: 2 (ORO: DI/H2O). Пригответе непосредствено преди употреба. Филтрирайте през филтърна хартия (Таблица с материали).

4. Набавяне на мастна тъкан

ЗАБЕЛЕЖКА: Висцералната мастна тъкан (ДДС) се отстранява от по-големия омент от хирурга в началото на операцията и се транспортира обратно в лабораторията върху лед за незабавна обработка. Трябва да се спазват универсални предпазни мерки при боравене с всички човешки тъкани и корозивни реагенти, включително извършване на цялата работа в ламинарна качулка, използвайки пълно лабораторно износване и без рецидив на иглите.

  1. Добавете 5-10 g непокътнат данък върху продажбите към 15-25 ml замразяващ буферен разтвор в 50 ml конична епруветка, за да потопите тъканната проба. Съхранявайте проби при -80 ° C до децелуларизация до 1 месец.
  2. Използвайте отделна проба от прясна вана за изолиране на пререадипоцити, както е описано в раздел 5.

6. Препарат за ECM на мастната тъкан

8. Метаболитно фенотипизиране

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

модел
Фигура 1: Работен поток за подготовка на ECM адипоцити. Ден 1: Целите висцерални мастни тъкани преминават през три цикъла на замразяване-размразяване, последвани от инкубация през нощта с ензимен храносмилателен разтвор # 1. Ден 2: След храносмилане с ензимен разтвор # 1, пробите се усвояват с ензимно разтвор за разлагане # 2 за една нощ. В този момент пробите са частично делипидирани. Ден 3: След ензимно разграждане # 2, пробите се инкубират в продължение на една нощ с екстракционен разтвор на полярен разтворител, който завършва делипидацията. След ден 3 пробите трябва да бъдат напълно делипидирани и бели/полупрозрачни на цвят. Пробите се измиват обилно с изплакващ буферен разтвор, след това със 70% етанол и се съхраняват в разтвор за съхранение при 40 ° C, докато могат да се напълнят с пресипоцити. Ден 4: Преадипоцитите се засяват в децелуларизиран данък върху продажбите за 14 дни, последвано от адипогенна диференциация. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

човешка
Фигура 2: Работен процес на изолиране на преадипоцитите. Данъкът върху продажбите се нарязва, смила се с колагеназа, филтрира се, центрофугира се и получената стромоваскуларна клетъчна пелета се покрива със злато и се култивира за разширяване на пресипоцитите. За повече информация относно изолирането на човешки пресипоцити и 2D културата на адипоцитите, вижте Baker et al. 2017 г. 21. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

извънклетъчна
Фигура 3: Сканиране на изображения с електронна микроскопия. Интактна мастна тъкан, децелуларизирана мастна тъкан и децелуларизирана мастна тъкан, която беше повторно населена с препоцити в продължение на 14 дни и диференцирана в адипогенна среда. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Подобни методи за изолиране на ECM от мастна тъкан и засяване с пресипоцити са публикувани, като доказателства сочат, че ECM може да насърчава адипогенната диференциация без класически адипогенни медиатори, включително cAMP агонисти. Агонисти на инсулин и PPAR 12, 14. Нашите данни са първите, които демонстрират специфично за заболяването регулиране на клетъчния метаболизъм от ECM в мастната тъкан, като се използват методи, при които адипоцитите се стимулират с класически фактори на адипогенна диференциация 11; подобни изследвания без адипогенни стимули са цел на бъдещите изследвания. Други имат подобно на заболяването специфично преливане на ECM клетки с ECM и клетки от белодробна тъкан 19, 20. Използвани са и алтернативни стратегии, включително създаване на матрици чрез смесване на хомогенизирани ECM препарати от мастна тъкан в пептидни хидрогели 12 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите не декларират никакви противоречащи си интереси.