Изолиране на протеини
Изолирането на практически чист индивидуален протеин (в такива случаи често се използва не съвсем успешният термин „хомогенен протеин“) е необходима предпоставка за изучаване на неговата структура и функционални свойства. Техниките, използвани за това, са много разнообразни и бързо се подобряват и заедно с развитието на микрометодите е все по-необходимо да се разширят процесите, за да се получат големи количества високо пречистени протеини за нуждите на медицината и биотехнологиите. Необходимостта от ефективни методи за разделяне на протеини стана особено остра с развитието на генно инженерни методи за тяхното производство. Тази глава разглежда само най-общите принципи на препаративната протеинова химия.
Характеристики на протеиновата изолация
Получаването на чисти химически отделни протеини включва както отстраняване на непротеинови примеси, така и отделяне на самите протеинови компоненти. Последната част на проблема, поради сходството на физикохимичните свойства на протеините, е особено трудна, поради което именно нейното решение определя избора на определени схеми за изолиране на протеини. Необходимо е да се вземат предвид някои поведенчески характеристики, присъщи на всички протеини.
Те включват, на първо място, способността на протеините да претърпят денатурация, тези. да претърпи такива промени в пространствената структура, които водят до загуба или частична загуба на функционални свойства. Вярно е, че в много случаи денатурацията е обратима, но тази обратимост не се осигурява автоматично, а изисква избора на специални техники за всеки отделен случай. В същото време напълно или дори частично денатурираните протеини са много уязвими на необратими увреждания, особено на действието на протеолитичните ензими, поради което условията, благоприятни за денатурация, трябва да се избягват по всякакъв възможен начин.
За да се предотврати топлинна денатурация, изолирането на протеини се извършва при ниска температура, обикновено при 4 ° С. Екстремните стойности на pH също трябва да се избягват. Протеините лесно денатурират при ниско рН поради протонирането на отрицателно заредени карбоксилни групи при нормални условия и произтичащото от това рязко преобладаване на положителни заряди, което благоприятства разгръщането на компактна структура. В алкална среда при рН 10 и по-високо, положителните заряди се губят поради протонирането на ε-аминогрупите на лизин и отново настъпва декомпенсация на зарядите на повърхността, дестабилизираща глобулата. В същото време фенолните хидроксили на тези тирозинови остатъци, които са били скрити в глобулата, след като са получили отрицателен заряд, са склонни да излизат на повърхността, което също допринася за денатурацията на протеина.
В още по-алкални разтвори възникват реакции, които необратимо увреждат протеина, - елиминиране на сяра от цистеинови и цистинови остатъци, β-елиминиране на фосфатни остатъци във фосфопротеини, елиминиране на полизахаридни вериги, прикрепени към серинови остатъци в гликопротеините. Остатъците от ненаситената аминокиселина, дехидроаланин, образуван в резултат на тези реакции, се прикрепят към близките ε-аминогрупи на лизин, за да образуват така наречения лизиноаланин, съединение, чието присъствие в киселинния хидролизат на протеина показва дълбоко увреждане на структурата му.
Причината за денатурацията може да бъде използването на органични разтворители, способни да нарушат системата от хидрофобни контакти в глобулата, което е от съществено значение за стабилността на протеините. Също така е необходимо да се вземе предвид възможността за денатурация на протеини на границата, особено по време на образуването на пяна. С отделянето на много малки количества протеин, което не е рядкост в съвременната биохимия, трябва да се има предвид загубите, причинени от неговата адсорбция., често необратими, върху повърхността на стъклени или полимерни материали, особено значими в крайните етапи на почистване.