Изолиране на мононуклеарни клетки
ИЗОЛИРАНЕ НА ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ МОНОКУЛАРИ
Изолиране на мононуклеарни клетки от периферна кръв
1. Подгответе градиента. В епруветка за центрофуга (обем 10-15 ml) със запушалка се добавят приблизително 3 ml смес от метризоат - фикол. Епруветката се оставя на масата, докато градиентът е стайна температура. (Не се препоръчва да се работи при 4 ° C.)
2. Вземете кръв. Изсипете го в конична колба, съдържаща дузина стъклени мъниста с диаметър 2 мм. Колбата се завърта внимателно с ръка, докато ударът на стъклените мъниста един върху друг и отстрани на колбата вече не може да се чуе, т.е. докато кръвта се сгърчи. (Не забравяйте за инфекциозната опасност, породена от човешката кръв.)
3. Разредете дефибринираната кръв с еднакъв обем среда (PBS или BSS) при стайна температура.
4. С помощта на пастьорска пипета внимателно поставете разредената дефибринирана кръв върху градиента. Върхът на пипетата се огъва на 90 ° и се изрязва с диамантен нож близо до завоя, за да се избегне смесването на градиента с кръв при наслояване. (Можете да направите и друго. Първо, поставете дефибринираната кръв в чиста епруветка за центрофуга и след това поставете под нея смес от метризоат - фикол.)
5. Центрофугирайте при 1500 g за 15 минути при стайна температура. (Не използвайте спирачката, за да спрете ротора на центрофугата, за да избегнете раздвижване.)
6. Еритроцитите и гранулоцитите се утаяват на дъното на епруветката, а на ядрената повърхност са разположени мононуклеарни клетки. Прозрачният слой на средата е аспириран, разположен директно над опалесцентния слой на мононуклеарните клетки. След това се събира слой от мононуклеарни клетки по цялата площ на напречното сечение на епруветката на границата. Клетките, прилепнали по стените, могат да се събират с върха на пипета. Мононуклеарните клетки се прехвърлят в чиста тръба за центрофуга.
7. Разредете суспензията на едноядрени клетки с поне четирикратен излишък от средата и разбъркайте добре. От този момент нататък обработката на клетките може да се извърши при 4 ° C. За да се концентрира MIC, суспензията се центрофугира при 300 g в продължение на 10 минути.
Например, 9% (w/v) разтвор на Ficoll се използва за разделяне на човешки кръвни клетки в градиент на плътността, за да се получи градиент с плътност 1,078 g/ml. За разделяне на клетките на плъхове се приготвя 14% (w/v) разтвор на Ficoll, за да се получи плътност от крайния градиент 1,087 g/ml. Ficoll се разтваря в дестилирана вода при стайна температура и интензивно разбъркване. Към 24 обема разтворен фикол се добавят 10 обема 32,8% (w/v) разтвор на натриев метризоат