Индуциран от пентилентетразол Kindling мишка протокол за модел (преведен на немски)

Обобщение

Този протокол описва метод за химическо възпламеняване с пентилентетразол и осигурява миши модел на епилепсия. Този протокол може също да се използва за изследване на податливостта към индукция на припадъци и патогенеза след епилептични припадъци при мишки.

Резюме

Въведение

Епилепсията е хронично неврологично разстройство, което се характеризира с повтарящи се припадъци и засяга около 1% от хората. Основните механизми на епилептогенезата и генерирането на гърчове при пациенти с епилепсия не могат да бъдат напълно изяснени в клиничните проучвания. Следователно е необходим подходящ животински модел за изследване на епилепсия 1.

Различни животински модели на епилепсия са използвани за изследване на физиологията на епилепсията и за идентифициране на антиепилептични лекарства 2, 3. Сред тези модели фармакологичната индукция на гърчове е често срещан метод за генериране на животински модел за изследване на патологията на епилепсията 4. Този метод е евтин и лесен. Електродно осветеното осветление също е често използван метод, но цената на процедурата е по-висока и методът изисква хирургически и електрически умения за предизвикване на повтарящи се припадъци 5.

Фармакологичната индукция също е от полза, тъй като времето и броят на пристъпите се контролират лесно. Генетични модели на мишки, които показват спонтанни припадъци, също се използват при изследване на епилепсия. Въпреки това, прогнозирането кога и колко често ще се появят припадъците в тези генетични модели може да е невъзможно 6. Необходима е система за наблюдение, за да се наблюдава епилептичното поведение на генетично модифицирани мишки 6.

Припадъците често се предизвикват от еднократно системно приложение на PTZ и възстановяването е много бързо, в рамките на 30 минути 4, 5. По този начин броят на припадъците в модела с PTZ-запалване е по-лесен за контролиране. Мониторингът на ЕЕГ обаче показва, че генерализирани пикове могат да се видят до 12 часа след PTZ-медииран припадък 20. Следователно животните трябва за предпочитане да останат под наблюдение в продължение на 24 часа след тонизиращия или миоклоничния припадък 21 за по-подробен анализ на механизмите, които запалват.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Комитетът по грижа и употреба на животните в Токийския институт по медицинска наука одобри всички експериментални процедури. Препоръчват се постнатални 8-16 седмични мишки. Всеки инбридинг щам е приемлив за експеримента. Мишките C57BL/6 са по-устойчиви на PTZ, докато мишките BALB/c и Swiss Albino са по-чувствителни към PTZ. В това проучване са използвани C57BL/6. Податливостта към PTZ също зависи от възрастта на мишката. В сравнение с по-младите мишки, по-възрастните мишки са по-огнеупорни към PTZ-35. Броят на животните, използвани за този метод, може да варира, но за всяко състояние са необходими минимум 6-10 животни.

Разтворете 2 mg/mL PTZ в стерилен 0,9% (w/V) NaCl. Пригответе PTZ в деня на употреба.

Наблюдавайте поведението на животните и записвайте резултатите.
1. Класифицирайте и изстреляйте епилептичното поведение, както следва 38, 39 (Фигура 1b):
  0: нормално поведение, без аномалии.
  1: Обездвижване, легнало по корем.
  2: Кимване на главата, лице, предни крака или миоклония на Megalosauridae.
  3: Непрекъснат миоклонус на цялото тяло, миоклонични дръпвания, опашка е вдървена.
  4: отглеждане на деца, тоничен припадък, падане настрани.
  5: тонично-клоничен припадък, падане по гръб, диво бързане и скачане.
  6: смърт.
Променете поведенческите критерии въз основа на Racine Score 40, в зависимост от експерименталните условия.

4. След анализа на пристъпите

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Повторното инжектиране на PTZ предизвиква увеличаване на тежестта на пристъпите. Шест мишки C57BL/6 бяха третирани с PTZ, а други 6 мишки бяха третирани с физиологичен разтвор като контролна група. Дозата на PTZ беше 35 mg/kg и бяха направени 10 инжекции. Резултатът от припадъците се увеличава постепенно с инжекции с PTZ, докато при физиологични инжекции не се наблюдават припадъци или ненормално поведение (Фигура 2) са били причинени. ANOVA, последван от теста на Bonferroni, показва значителна разлика между групата, лекувана с PTZ, и групата, лекувана с физиологичен разтвор.

Повтарящият се припадък насърчава отклоняващото се образуване на аксонови клонове (мъхести фибри) и анормална миграция на гранулирани клетки в хипокампуса. Мишките бяха лекувани с PTZ за 25 инжекции (дозата беше коригирана от 24 mg/kg до 35 mg/kg, за да се запази тежък припадък при мишки, без да се предизвиква смърт от тежък припадък). Мозъкът на мишката беше фиксиран 3 седмици след последното инжектиране. Контролните мозъци бяха фиксирани преди PTZ инжекциите. Мозъчните филийки бяха имунооцветени с анти-синаптопорин (х 500) и анти-ZnT3 (х 500) антитела срещу мъхообразните фибри (Фигура 3А) и с анти-двойното кортиново антитяло (х 200), за да се наблюдава анормалната миграция на гранулатни клетки (Фигура 3А). Мъховите влакна поникват в гранулирания клетъчен слой, записани с дискове, третирани с PTZ (фиг. 3А). Клетките на новородени гранули, имунореактивни за двойния кортин, са разположени в хилуса в третираните с PTZ филийки (Фигура 3А) наблюдаваното. Гранулираният клетъчен слой и хилус, показани на фигура ЗА е на Фигура 3 bпоказани.

Дискусия

Тук представяме общодостъпен протокол за установяване на фармакологичен животински модел на епилепсия. Химическото възпламеняване, медиирано от PTZ, има дълга история и е широко приет модел за изследване на хистопатологията и клетъчната патология на епилепсията 41. Химическият модел на запалване на епилепсията е изследван преди това от Suzdak и Jansen, 1995 42. Фармакологичната индукция на гърчове, особено при PTZ, е прост и ясен метод за причиняване на тежки гърчове. Промените в инжекционната доза корелират с тежестта на гърчовете. Следователно е много лесно да се идентифицира подходящата доза в множество проучвания чрез промяна на дозата на PTZ и произтичащото от това поведение.

Много изследователи са се опитали да моделират нокаутиращи или нокаутиращи мишки като епилепсия и са успели да произведат мишки, които имат спонтанни гърчове 43, 44. Въпреки това, фармакологичната индукция на гърчове остава добър модел за епилепсия. Друг често срещан метод за индукция на припадъци, наречен генетична модификация, включва имплантиране на електроди в мозъка на животното и предизвикване на електрошокови медиирани припадъци. Този метод е скъп, труден и изисква хирургически умения за имплантиране на електрода на точното място в мозъка 5.

Химичната индукция на конвулсии позволява бързо изследване на епилептогенезата и скрининг на антиепилептични лекарства на ниска цена 2, 4. Честотата и тежестта на спонтанните гърчове и SE се различават в зависимост от използваното лекарство. Каинова киселина и пилокарпин се използват главно за провокиране на SE и по-късно хронични спонтанни или рецидивиращи гърчове 45, 46, 47. От друга страна PTZ се използва както за насърчаване на SE, когато се развиете във висока доза, така и за химически възпалени животни, когато се дава в субконвулсивна доза 48,49. Освен това са известни механизмите на конвулсивните лекарства, които предизвикват гърчове. Например, блокирането на припадъчния механизъм може да помогне за идентифициране на антиепилептични лекарства. Генетичните модели, от друга страна, са необходими за изследване на механизмите, които причиняват епилептични припадъци. След изясняване на механизмите, причиняващи припадъци, може да се започне скрининг за антиепилептични лекарства.

В показаните тук представителни резултати поведението на животните се наблюдава в продължение на 30 минути след PTZ приложение. Както е споменато в раздела за протокола, поведението на животните за предпочитане се наблюдава в продължение на 24 часа или поне 6-10 часа след инжектирането на PTZ, особено когато точките на припадъци достигнат 3 или повече. Въпреки че е необходима система за наблюдение на животните, която да наблюдава животното през целия ден, продължителното наблюдение е от решаващо значение за получаване на задълбочено разбиране за епилепсията. Освен това продължителността на изземването и латентността на припадъка са полезни мерки за събиране. Тези измервания са важни, когато има промени в продължителността на пристъпа и латентността по отношение на времето и тежестта на пристъпа.

Изследвана е хистопатологията след изземване на животни с химическо гориво, особено в хипокампуса. Повтарящите се припадъци или SE предизвикват мъхообразни фибри, 27, 28, анормална миграция на новородени гранули неврони 25, 29, астроглиоза в хипокампуса 30 и апоптоза на пирамидални неврони 31, 32. тези хистологични промени в мозъка нарушават неврологичните функции при пациенти с епилепсия. Например, асоциацията на епилепсия с разстройство от аутистичния спектър (ASD) и интелектуални увреждания (ID) се признава 51, 52, 53. Дали епилептичните припадъци предизвикват ASD и или ASD и ID предизвикват епилептични симптоми, все още е сложен въпрос. Последни проучвания показват, че PTZ-медиираните припадъци предизвикват ASD-подобни социално-когнитивни увреждания 54 и ID-подобни дефицити на обучение 55, 56, 57. Тези резултати показват, че хистопатологията, медиирана от епилепсия, причинява невронна дисфункция и психиатрични разстройства.

Хистологичните промени, насърчавани от епилепсия, отнемат време да се развият след индукция на гърчове. Фармакологичната индукция на гърчове е полезна в това отношение, тъй като изследователите могат да контролират времето, броя и тежестта на гърчовете при животните. Включително химическо възпламеняване, животинските модели на епилептогенеза продължават да насърчават разследването на механизма на индуциране на епилепсия и свързаните неврофизиологични нарушения.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите не декларират конфликт на интереси.