Идентифициране и характеризиране на варианти на ATP13A2 и тяхното значение за

Идентифициране и характеризиране на варианти на ATP13A2 и тяхното значение за невродегенеративни заболявания Инаугурационна дисертация за получаване на докторска степен на Факултета по математика и естествени науки на Университета в Кьолн, представена от Андре Хаймбах от Есен Кьолн 2009

характеризиране

Тази дисертация е изготвена с одобрението на Факултета по математика и естествени науки на Университета в Кьолн към Института за човешка генетика (директор: проф. Д-р Brunhilde Wirth) на университета в Кьолн под ръководството на проф. Д-р. Торстен Хопе и проф. Д-р Кристиан Кубиш направи. Рецензент: проф. Д-р Торстен Хопе проф. Д-р Кристиан Кубиш Ден на последния устен изпит: 12 януари 2010 г.

Съдържание Съдържание Съдържание Списък на съкращенията 1 Въведение 1 1.1 Невродегенеративни заболявания 1 1.1.1 Паркинсонизъм 1 1.1.2 Синдром на Kufor-Rakeb и ATP13A2 5 1.2 P-тип АТФази 6 1.2.1 Транспортиране на вещества чрез биологични мембрани 6 1.2.2 АТФ-помпи 6 1.2.3 Структура на Р-тип АТРази 7 1.2.4 Функционален механизъм на Р-тип АТФази 8 1.2.5 Класификация на Р-тип АТФази 10 1.2.5.1 Тип АТФази 11 1.2.5.2 Тип II АТФази 11 1.2.5.3 Тип III АТФази 11 1.2. 5.4 Тип IV АТФази 12 1.2.5.5 Тип АТФази 12 1.2.6 Мутации в АТФази като причина за заболявания 13 1.3 Цели на работата 15 2 Материали и методи 16 2.1 Химикали 16 2.2 Консумативи 16 2.3 Общи решения 16 2.4 Ензими 17 2.5 Търговски реагентни системи ( Комплекти) 17 2.6 Дезоксирибонуклеотидни трифосфати (dntp) 17 2.7 Вектори за клониране 18 2.8 Използвани устройства 18 2.9 Бази данни и други уебсайтове 19 2.10 Софтуер 20 2.11 Молекулярни биологични методи 20 2.11.1 Полимеразна верижна реакция (PCR) 20 2.11.2 Дизайн на грунд 20 2.11.3 PCR реакционни партиди 21 I

Списък на съкращенията Списък на съкращенията A Абсорбция A Аденин AA Аминокиселина A. дестилирана вода Фиг. Фигура AK Антитела ABI Applied Biosystems AP алкална фосфатаза ATP аденозин трифосфат BAC бактериална изкуствена хромозома BCA бицинхонинова киселина (бицинхонинова киселина; 2,2-хинолин-4-бикарбонат-4-бикарбонат-4,4-бикарбонат-4-бикарбонат-4-бикарбонат-4-бикрил BSA говежди серумен албумин (говежди серумен албумин) C цитозин cdna ДНК копие на RNA comp-het съединение-хетерозиготен DAPI 4 6-диамидино-2-фенилидол ddntp дидеоксинуклеотид трифосфат Del Deletion DMEM Dubecco s Modified Eagle s Medium DMSO диметил диоксид диноксид диметилсулфоксид DMSO диметилсулфоксид 5 трифосфатни dpc дни след коитум DTT Dethiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Етилендиаминтетраоцетна киселина EF ембрионални захранващи клетки (миши) ER ендоплазматичен ретикулум ES ембрионални стволови клетки (миши) F напред грунд (грунд в посока напред) F от F c FCS G. G антиген-свързващ Фрагмент от константно съотношение на антитяло от антитяло f etal телешки серум гуанин грамове V

Списък на съкращенията h час HCl солна киселина HEK човешки ембрионален бъбрек (човешки ембрионални чернодробни клетки) хетерозиготен хомозиготен HRP хрян пероксидаза (хрян пероксидаза) H 2 O вода IgG имуноглобулин от група G IgM имуноглобулин от група M IHF интеграция гостоприемник J Joule k kilo kb двойки килобази kda килодалтони KO нокаутира синдром на KRS Kufor-Rakeb 1 литър LAMP лизозомен асоцииран мембранен протеин LB Luria Bertani m мили (фактор 10-3) M моларен mа милиа ампер Mb двойки мегабаза min минути MMC митомицин C MOPS 3-N-морфолино-пропансулфонова киселина MPTP 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин МТТ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид n nano (фактор 10-9) N нормален NaCl физиологичен разтвор NADH никотинамид аденин динуклеотид NADPH никотинамид аденин динуклеотид фосфат NaOH разтвор на натриев хидроксид Нео неомицин OD n оптична плътност (абсорбция при дължина на вълната от n нанометри) p pico (фактор 10-12) VI

Списък на съкращенията PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNase rpm RT SDS sec T TAE Taq TE TM U UPS UV V WT w/v полиакриламид полиакриламид гел електрофореза полимеразна верижна реакция Паркинсонова болест (болест на Паркинсон) протеин дисулфид изомераза отрицателен декаден логаритъм на водородния логаритъм -Инхибитор коктейл обратен праймер (грунд в обратна посока) относителна влажност (относителна влажност) рибонуклеаза обороти в минута (обороти в минута) стайна температура натриев додецил сулфат секунди тимин трис-ацетат-EDTA Thermus aquaticus Tris-EDTA трансмембранен домейн единица - определена единица на ензимна активност убиквитин- Протеазомна система ултравиолетова светлина волта див тип тегло на обем VII

Материал и методи 2. Материал и методи 2.1 Химикали Използвани са химикали, органични вещества и разтворители с обозначение за качество pro от следните компании: Amersham (Freiburg) AppliChem (Darmstadt) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Sparks/САЩ) Fermentas Life Sciences (St. Leon-Rot) Fluka (Taufkirchen) GE Healthcare (Мюнхен) Invitrogen (Карлсруе) Merck (Дармщат) New England Biolabs (Франкфурт на Майн) Perkin Elmer (Massachusetts/USA) Pierce (Rockford/САЩ) Roche (Mannheim) Sigma-Aldrich (Taufkirchen) 2.2 Консумативи Пластмасовите изделия и реакционните съдове са получени от Greiner (Frickenhausen) и Sarstedt (Nümbrecht). 2.3 Общи разтвори Освен ако в протокола не е посочено друго, за всички буфери, разтвори и среди се използва дестилирана вода (A. dest). TE буфер (ph 8) 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA ad 500 ml HPLC-H 2 O, стерилен филтър, съхранение при -20 C TE -4 буфер (ph 8) 10 mm Tris-HCl 0,1 mm Na 2 -EDTA стерилен филтър, съхранение при -20 C 10 X PBS (ph 7.4) 80 g NaCl 2 g KCl 14.4 g Na 2 HPO 4 2.4 g KH 2 PO 4 автоклав до 1 l H 2 O, Съхранение при RT 16

Материал и методи 2.7 Вектори на клониране Таблица 2.2: Използвани вектори (векторни карти в приложението) Обозначение Описание Размер [bp] Източник pcdna 3.1 V5/вектор на експресия 5523 Invitrogen pdonr221 Вектор на клониране 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Вектор на изразяване 7767 Invitrogen PPNT насочен вектор 7200 AG Zimmer pdonr -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Използвани устройства Табл. 2.3: Използвани технически устройства Модел на устройството Производител Автоклав Парен стерилизатор Varioklav H + P Лабораторна технология Инкубатор Hera Cell 150 Термофорезна камера Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Sure Lock Уред за електропорация на инвитроген Gene Pulser System Biorad Capacitance Удължител Разработваща машина Biorad Curix 60 Agfa Geiger брояч LB 124 Berthold гел система за документиране Chemidoc XRS Biorad отоплителна/разбъркваща плоча MR 3001 Heidolph хибридизационен шкаф тип 30 Специален Hyb Bachofer инкубационен шейкър Innova 44 микроскоп Axioplan2 Zeiss нуклеинова киселина/измервателно устройство Nano Drop ND-1000 New Brunswick С. научен PeqLab ph метър inolab ph ниво 1 WTW помощ за пипетиране Изследване Eppendorf PCR система в реално време Easypet 7500 PCR система в реално време (Taq-Man) Eppendorf ултрачиста водна система Milli-Q; Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker Roller Mixer SRT 1 Stuart Applied Biosystems 18

Материали и методи Sequencer ABI Prism 3100 Генетичен анализатор Приложни биосистеми Устройства за напрежение Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Basic Bio-Rad стерилна работна маса Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Термоциклер лед Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems Thermomiorf IKA Benchtop Centrifuge Galaxy Mini VWR Transfer Module X-Cell II Blot Module Invitrogen Ultrasonic Bath USC 100T VWR Ultracentrifuge Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV Crosslinker CL-1000 UV Crosslink UVP UV Chamber GS Gene Linker UV Chamber Bio Rad Vortex Reax Top Heidolph Waage Acculab Баланс Vicon Sartorius (прецизен баланс) ARJ 120-4M водна баня Kern WB22 Memmert центрофуга Centrifuge 5415D Eppendorf Centrifuge 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Бази данни и други уебсайтове BACPAC Resources Center BDGP BioTools3: wwwtacg BioTools3. NEB P-Type ATPases UCSC Vector Designer http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/

exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19