Хранителни компоненти и тяхното влияние върху патогенезата на автоимунния диабет при хора и
1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Катедра по хранителна физиология Хранителни компоненти и тяхното влияние върху патогенезата на автоимунния диабет при хора и мишки Daniela Bettina Müller Пълно копие на докторската дисертация, одобрена от Weihenstephan Science Center for Nutrition, Land Use and Environment в Техническия университет в Мюнхен. Доктор по битови и хранителни науки Председател: Изпитващ дисертацията: Унив.-проф. Д-р J. J. Hauner 1. Унив.-проф. Д-р Х. Даниел 2-ри ап. Проф. Д-р A-G. Ziegler Дисертацията е представена в Техническия университет в Мюнхен на и приета от Научния център на Weihenstephan за хранене, земеползване и околна среда на.
2 За двамата ми дядовци
3 Съдържание Съдържание 1 Задача Въведение и преглед на литературата Основи на диабет тип 1 Значение на генетиката Патогенеза и имунологичен фон на диабет тип 1 Пшеница и нейните протеинови фракции Целиакия и връзката между диабет тип 1 и цьолиакия Влияние на пшеничните протеини върху развитието на автоимунен диабет при животински модели Диабет тип 1 Влияние на диетичните фактори върху развитието на автоимунен диабет в животинския модел на кравето мляко и неговите протеинови фракции Влияние на протеините на кравето мляко върху развитието на автоимунен диабет в животинския модел Влияние на пшеницата и кравето мляко при диабет тип 1 Асоциация между свързаната с червата имунна система и автоимунния диабет Допълнителни хранителни компоненти и техния възможен потенциал Асоциация с диабет тип 1 Материал и методи Изследвания върху модела на мишка NOD Група мишки Диети Протокол Частичен експеримент 1 и 1а Протокол Частичен експеримент Протокол Частичен експеримент I.
4 Съдържание 3.2 Експериментални методи Екстракция на зърно за получаване на протеинови фракции Производство на протеинови екстракти от храни или фуражи Електрофоретично разделяне на протеиновите фракции (SDS-страница) Определяне на съдържанието на протеин в екстрактите Измервания на автоантитела на IgG инсулин в миши и човешки серуми Анализ на свързване на радиолиганда с хранителни компоненти IAA афинитет с пилешки инсулин IgA инсулин автоантитела измервания в човешки серуми Статистика Резултати Експерименти с хранене с NOD мишки Консумация на храна и развитие на теглото на NOD мишки в експериментални групи Частичен експеримент 1 Пшеница и съдържащ казеин фураж в сравнение с базална диета Кумулативен риск от диабет на мишките NOD в частичния експеримент с разпространение на автоантитела на инсулин NOD мишки на възраст от десет седмици от живота при частичен експеримент Честота на диабет при NOD мишки преди и след 25 седмици от живота при частичен експеримент частичен експеримент 2 Количествено определяне на компонентите на пшеница и пшеница ерация и качество на екстрахираните пшенични фракции Кумулативен риск от диабет на NOD мишките в частичния тест Преобладаване на инсулиновите автоантитела на мишките NOD на възраст десет седмици при частичен тест II
6 Съдържание 5.1 Експерименти с хранене с NOD мишки Ефекти на различни протеинови източници върху развитието на диабет в модела NOD Ефекти на шахматни пшенични добавки и отделни фракции от пшеничен протеин върху развитието на диабет в модела NOD Влияние на други хранителни компоненти в диетата на малки деца върху развитието на диабет в NOD модела Заключващо разглеждане на хранителните експерименти в NOD -Модел реактивност на човешки инсулинови автоантитела с пилешки инсулин и IgA измерване на изотипа Обвързващо поведение на инсулиновите автоантитела с пилешки инсулин в човешки серуми Идентификация на IgA инсулинови автоантитела изотипи в човешки серуми Изследване на свързването на инсулиновите автоантитела с отделни протеини с хранителни компоненти в човешки серуми Фракции от краве мляко Окончателно разглеждане на тестовете за кръстосано реактивни автоантитела срещу инсулин Бъдещи перспективи Резюме и заключения Литература IV
7 Съдържание Съдържание. Списък на фигурите. Списък на таблици. Списък на съкращенията. I-V VI-VIII IX-X XI Предишни публикации. XII автобиография. XIII-XIV благодарност. XV V
10 Списък на фигури Фиг. 26 Свързване на IAA с мляко, млечни протеини, формули и пшеница в сравнение с човешки инсулин Фиг. 27 Криви на свързване на IAA с хранителни компоненти 75 Фиг. 28 Криви на свързване на IAA с млечни протеини Фиг. 29 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с Инсулин (част 1) Фиг. 30 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с инсулин (част 2) Фиг. 31 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с инсулин (част 3) VIII
12 Списък на таблици Табл. 20 Анализ на концентрацията на протеин в екстрахираните хранителни разтвори в различни разреждания и получените средни стойности Табл. 21 Характеристики на изследваните лица, чиито IAA се свързват с екстракт от мляко на прах X
13 Списък на съкращенията Списък на съкращенията Фиг. Фигура AK Антитяло аспарагин cpm радиоактивно разпадане в минута (брои в минута) GAD (A) (антитела срещу) глутамат декарбоксилаза HLA комплекс за хистосъвместимост (човешки левкоцитен антиген) I (A) A Инсулин (авто) антитяло IA-2 ( А) (Антитела срещу) протеин тирозин фосфатаза IA-2 ICA островни клетъчни антитела Ig имуноглобулин MHC основен комплекс за хистосъвместимост мин. Протоколи n.a. неизвестен NOD недиабетно диабетно RBA анализ на свързване на радиолиганди обороти в минута кръгове в минута T1D диабет тип 1 Таблица TBST Tris буфериран физиологичен разтвор плюс Tween TBT Tris буфериран Tween t-tg тъкан-транглутаминаза vs. срещу СЗО Световната здравна организация ZnT8 Zinc Transporter 8 XI
16 задачи, които биха могли да станат под въпрос като потенциални първоначални целеви антигени на IAA. Като цяло тази работа трябва да разработи възможното влияние на отделните хранителни компоненти върху имунния процес на автоимунен диабет. Използвайки данните, получени in vivo върху модела NOD, потенциално диабетогенните хранителни компоненти се тестват върху човешки серуми. Използвайки тези in vitro модели, ще бъде изследвано до каква степен имунните процеси на диабет тип 1 могат първоначално да бъдат предизвикани от кръстосани реакции с хранителни компоненти. Резултатите от тези експерименти биха могли да опишат допълнителни, неизвестни досега механизми на патогенезата на диабета и по този начин да бъдат използвани за разработването на първични терапии за предотвратяване на развитието на диабет тип 1 в ранна детска възраст. 3
41 Материал и методи (диета D), втора група остана на диета, съдържаща пшеница A, а трета група остана на диета без пшеница B. Женските малки в развъдната група на глутена и без казеин диета C бяха разпределени в тестова група, състояща се от 9 женски животни, останали на диета С (виж фиг. 4). Размножаващи се двойки Безглутенова, съдържаща казеин диета B Диета без глутен и казеин C Тестови групи Диета B n = 12 Диета A n = 12 Диета D n = 12 Диета C n = 9 Фиг. 4 Разпределение на женските NOD мишки към развъдните и тестовите групи в частичния тест 1. Мъжките млади животни от размножителната група на безглутенова диета В бяха отделени от язовирите след лактация на възраст от три седмици, както е описано за женските животни, и разделени в три тестови групи. Аналогично на груповото разпределение на женските мишки, една от групите получава референтна диета (диета D), втора получава диета, съдържаща пшеница A, а трета група остава на безжитна диета B (виж фиг. 4а). Размножаване на двойки безглутенова, съдържаща казеин диета B Тестови групи Диета B n = 11 Диета A n = 10 Диета D n = 12 Фиг. 4a Разпределение на мъжките мишки NOD към развъдните и тестовите групи в суб-експеримент 1a. 28
46 Материал и методи За да се отделят протеиновите фракции, съдържащи се в пшеницата, една от друга се извършва модифицирана триетапна екстракция, при която в първия етап на екстракция албумините и глобулините присъстват в супернатантата, а във втория етап на екстракция проламините (глиадините) се съдържат в супернатантата и с В последния етап глутените бяха разделени (Wilson and Goulding 1991, Mimouni et al. 1998, Nicolas et al Idris et al. 2003). Екстракция на брашно Албумини и глобулини Центрифугиране> 2x Екстракция на глиадин с екстракция на утайка> 3x Екстракция на глютелинов седимент (N 2 атмосфера) Центрифугиране> 2x Центрифугиране на всички супернатанти Съхранение при утаяване при 18 C Фиг. 7 Схема на екстракция на протеини и отделяне на фракциите от пшенично брашно. 0,1 g търговско пшенично брашно тип 550 се претеглят, добавя се 1 ml буфер на Sörensen (рН 7,35) и сместа се разклаща при 4 ° С в продължение на 20 минути. След центрофугиране (20 минути, 1000 об/мин, Sorvall RC 5B суперскоростна центрофуга) при 4 ° С, супернатантът се отстранява и утайката се екстрахира отново, използвайки същия метод след добавяне на буфер на Sorensen. Двата супернатанта се комбинират и се съхраняват при 4 ° С до завършване на следващите етапи на екстракция. 33
60 резултата Получаване на количеството албумини и глобулини, които се прилагат на NOD мишките с питейната вода. За да се провери методът на екстракция, основните протеини на пшеничното брашно се фракционират и чистотата на отделянето се проверява чрез гел електрофореза (материал и методи 3.2.3). Стандартни албумини и глобулини Глутенини Глиадини Фиг. 10 Електрофоретично разделяне на пшеничните протеинови фракции върху 12% полиакриламиден гел. Отделните протеинови фракции се присвояват на съответните ивици и молекулните тегла са показани в kda от лявата страна. В допълнение, ефективността на екстракцията се определя чрез количествено определяне на протеини с BCA Protein Assay Kit (вж. Табл. 16 и Материали и методи 3.2.4) и приблизително 50% добив от желаната фракция на албумин и глобулин е използван като основа за екстракциите поставени. 47