Грипен вирус
Птичият грип (класическа чума на птиците, ексудативен тиф, кафяво-швегева болест на пилета и др.) Е остро заразно вирусно заболяване, характеризиращо се с обща депресия, оток и увреждане на дихателните и храносмилателните органи.
Заболяването се съобщава в различни страни по света. Рядко се среща под формата на класическа чума на птиците. По-често се проявява като епизоотични огнища в дихателна форма или с преобладаваща лезия на стомашно-чревния тракт.
Вируси от птичи грип, изолирани от пилета, пуйки, патици, пъдпъдъци, фазани, дървесни групи, папагали, токачки и други птици.
Характеристики на патогена. Вирусът принадлежи към семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus A. Вирионите са плеоморфни (различни), по-често кръгли, с диаметър 80-120 nm. Те се състоят от нуклеокапсид с винтова симетрия и липопротеинова мембрана, която образува издатини. Геномът е представен от едноверижна линейна молекула минус-РНК, състояща се от осем фрагмента.
Устойчивост на физични и химични влияния. При ниски температури и в лиофилизирано състояние вирусът се задържа до две години. При температура 55 ° C се инактивира за 1 час, при 60 ° C за 10 минути, при 65-75 ° C за 2-5 минути. Вирусът губи своята инфекциозна активност под въздействието на формалдехид, разяждащи основи, слаби киселини, хлорсъдържащи съединения.
Антигенна структура и активност. Вирионите на вируса на пилешкия грип съдържат вътрешни антигени - NP, протеини M, P1, P2, P3 и външни антигени - хемаглутинин (H) и невраминидаза (N). Вътрешните антигени индуцират образуването на свързващи комплемента и утаяващи антитела. Външните антигени имат хемаглутинираща активност и индуцират неутрализиращи антитела, които са отговорни за напрежението на антивирусния имунитет.
Антигенна променливост и връзка. Идентифицирани са 15 подтипа хемаглутинин и 9 подтипа невроминидаза с минимална кръстосана активност (между подтипове) при серологични реакции. Възможно е също да има вариации в рамките на подтип.
Антигенната връзка на изолатите се установява в RTGA (за определяне на сходството в хемаглутинина), в PTNA (за определяне на сходството в невроминидазата), в RID (за определяне на сходството в хемаглутинина и невроминидазата).
Култивиране на вируса. Всички щамове на птичи грипен вирус в лабораторни условия се размножават в пилешки ембриони, когато са заразени в алантоисната или околоплодната кухина. След адаптация някои щамове се размножават в клетъчни култури на фибробласти на пилешки ембрион, маймунски бъбреци, човешки ембрионални бели дробове и други първични клетъчни култури (WI-38, пилешка миелобластоза). Някои щамове образуват плаки в първичната култура на пилешки фибробластни клетки.
Хемаглутиниращи и хемодсорбиращи свойства. Всички вируси на птичия грип аглутинират еритроцитите на пилета, морски свинчета, зайци, коне, овце и други животни. За разлика от вируса на нюкасълската болест, вирусът на птичия грип аглутинира еритроцитите на коне и овце, който се използва за разграничаване на ембрионалните щамове на птичия грипен вирус от нюкасълската болест,
Хемадсорбентните свойства се проявяват с еритроцитите на пилетата по време на култивирането на вируса в културата на фибробласти на пилешки ембриони.
Експериментална инфекция. Размножава се при пилета и пилета по всякакъв метод за заразяване с грипни подтипове А (H7N1 и H5N3). Белите мишки се разболяват от интраназални и интрацеребрални инфекции. Експерименталната вирусна инфекция протича безсимптомно. Експерименталната инфекция при естествено податлива птица зависи от вирулентността на вируса, степента на адаптация към биологичната система и съпътстващите инфекции.
Клинични признаци. Вирусните щамове с различна вирулентност причиняват различни форми на клиничното протичане на заболяването. Депресията, загубата на чувствителност, цианозата на лигавиците и кожата и отокът на подкожната тъкан са характерни за класическата чума по птиците. Смъртността може да достигне 80% или повече. При дихателна форма се наблюдават сънливост, кихане, хрипове, задух, изпускане от носа и очите, разрошено, забавяне на развитието и намалено производство на яйца при възрастна птица. Смъртността, в зависимост от вирулентността на щама, чувствителността на птицата и условията на отглеждане, може да варира от 1 до 80%. При стомашно-чревната форма на заболяването основният клиничен симптом на фона на депресия, отказ от хранене и намаляване на производството на яйца е диарията. Смъртта не надвишава 5%.
Има и асимптоматичен курс (особено сред домашните патици).
Патологични промени. При аутопсия на птица, в зависимост от хода на заболяването, могат да се наблюдават кръвоизливи в паренхимни органи, скелетни мускули, храносмилателен тракт, огнища на некроза във вътрешните органи и централната нервна система. Щамове с пневмотропно действие причиняват катарално възпаление в носните проходи, синусите, трахеята и белите дробове. В някои случаи катарално-хеморагичен ентерит, нефрит.
Локализация на вируса. Входната врата за вируса е главно горните дихателни пътища, където вирусът се подлага на първично размножаване. Натрупвайки се, той прониква в кръвоносната и лимфоидната системи, откъдето попада в епителните клетки на дихателните пътища, паренхимните органи, мозъка, червата, съдовия ендотел (вторично размножаване).
Източник на инфекция - болна птица, която предава вируса чрез въздушни капчици, както и хранителна, когато водата и фуражите са заразени с изпражнения. Дивите мигриращи птици (лебеди, патици, чайки и др.) Могат да разпространяват вируса на големи разстояния. При естествени условия спектърът на патогенността не е еднороден и зависи от подтипа. Например подтипът H7N1 причинява по-често класическа чума по птиците сред пилетата, а водолюбивите птици са по-малко податливи на нея. Дивите патици са не само носители, но и резервоари на инфекция, причинявайки сезонни заболявания сред мочурливите птици. Вирусът на грип от пуешки грип е патогенен за пуйките и пилетата. Вирусът на вируса на пилешкия грип е патогенен за пилетата и пъдпъдъците.
Проблемът с междувидовото предаване между птичи, свински и човешки грипни вируси все още не е решен напълно. Дивите водни птици са резервоари с различни подвидове вируси. И в онези популации, където те са в близък контакт с хора, свине, могат да се образуват нови по-патогенни щамове на грипния вирус, дължащи се на генната рекомбинация. Грипният вирус с формула H2N2 не е изолиран от хората от 1968 г., но е изолиран от птици и, ако се обърне, може да стане епидемия.
Диагностика. Възможно е да се диагностицира инфлуенцата по птиците въз основа на епизоотологични, клинични, патологични данни и лабораторни резултати, които са от решаващо значение.
Вземане и подготовка на материал. Патологичният материал се изпраща в лабораторията от болна птица, взета през първите 2-3 дни на заболяването с изразена клинична картина, или от мъртва птица, или убита за диагностични цели в острия стадий на заболяването.
От болна птица се вземат намазки от трахеята и клоаката със стерилен тампон от памучна марля или пяна, който се поставя във флакон с 2 ml физиологичен разтвор (рН 7,0-7,2) или разтвор на Ханкс с антибиотици (пеницилин и стрептомицин, 500-1000 единици всяка)/ml) и се доставят в термос с лед. За ретроспективна серодиагностика в началото на заболяването и по време на възстановителния период се взема кръв от болна птица за сдвоени серуми. В този случай кръвен съсирек, който остава от първата кръвна проба, също се изпраща за изследване като материал, съдържащ вирус.
От мъртва или убита птица те вземат парчета от далака, мозъка, трахеята, белите дробове, въздушните торбички, синусите, отделите на червата или изпращат пресни трупове (поне два или три).
Лабораторна диагностика. Включва индикация и изолиране на вируса, неговата идентификация, както и ретроспективна диагноза.
Индикация вирусът се извършва чрез експресни методи, които включват методи за цитоскопия и проста флуорохромация.
При цитоскопия в цитонамазки отпечатъци от лигавиците на дихателните пътища, оцветени по един от методите (според Романовски, Пигаревски, Биковски), в цитоплазмата на клетки, включени тела на виолетово (Романовски оцветяване) или яркочервено (Пигаревски, Bykovsky оцветяване) цвят са намерени.
Методът на проста флуорохромация дава възможност да се открият ясно очертани червени или оранжеви гранули, разположени в цитоплазмата на клетките в цитонамазки, съдържащи грипния вирус (с помощта на разтвор на акридинов оранжев 1:10 000) в луминесцентен микроскоп.
Изолирането на вируса се извършва чрез заразяване на пилешки ембриони, клетъчна култура, а също и поставяне на биоанализ върху пилета.
Заразени са 9-10-дневни пилешки ембриони (най-малко пет на проба), с които тестовата суспензия се инокулира в амниотичната или алантоисната кухина по конвенционален метод. Яйцата се инкубират в продължение на 72 часа. Извън ембрионалната течност на всеки ембрион се изследва отделно за откриване на вирусен хемаглутинин в капка RHA с 1% суспензия от пилешки еритроцити. В случай на отрицателна RHA се извършват още 3-5 слепи пасажи, като се използва ембрионалната течност от предишния пасаж за инфекция с EC. Тестът се счита за отрицателен, ако в 3-5 слепи пасажа няма положителен RHA и патогенното действие на вируса (смърт на TBE).
Клетъчната култура се заразява по-рядко от CE. За това се използва първична култура от пилешки фибробластни клетки. CPP обикновено се открива след 24-48 часа, въпреки че най-високият вирусен титър (10 5 -10 7 EID50/ml) се наблюдава след 2-5 пасажи. Ваксинираната с култура течност се изследва в RHA и RHA.
Биопроба върху пилета се извършва, ако първите два метода за изолиране на вируса изискват потвърждение. Тестваната суспензия се инокулира на 2-3-месечни пилета по всеки метод (подкожно, интрамускулно, върху конюнктивата и др.). Смъртта настъпва в зависимост от вирулентността и дозата на вируса след 36-72 часа.
Идентификация на вируса. RTGA е най-простият и надежден метод за идентифициране на вирус. Реакцията се провежда с диагностичен комплект, съдържащ 15 референтни щамове специфични серуми. За диференциална диагноза с нюкасълска болест, реакцията се извършва паралелно с референтен специфичен серум срещу нюкасълска болест.
RTGA се настройва с помощта на микро или макро метод съгласно общоприета техника. Използваните в реакцията серуми се освобождават от лабилни на топлина инхибитори чрез нагряване при 60 ° С в продължение на 30 минути, от термостабилни инхибитори чрез преминаване през специфичен серум, CO2 или добавяне на парчета сух лед. RTGA се счита за положителен, ако серумът напълно инхибира хемаглутиниращата активност на изолирания вирус.
RTGAD се поставя съгласно общоприетата техника в културата на пилешки фибробластни клетки. Използват се набор от референтни щамове специфични серуми (предварително освободени от инхибитори) и пилешки еритроцити. Изследваният вирус се счита за идентифициран в RTGAD, ако референтният серум блокира хемадсорбцията.
RSC се използва за определяне на родовата специфичност на изолирания вирус, когато RTGA не успява да установи връзката между изолираните (епизоотични) и референтни щамове на грипния вирус чрез специфични серуми към тях. В този случай RSK се поставя с референтни специфични серуми срещу грипни вируси от родове A, B, C и се установява родовата принадлежност на щама.
PH се използва в някои неясни и противоречиви случаи, поради което те рядко се използват в диагностиката.
RIF се отнася до експресни диагностични методи. Използват се директни и индиректни версии, за които отпечатъци от петна се изготвят ex tempore от убита болна или прясно паднала птица и след това се използва съответната опция за реакция по общоприетия метод.
Най-модерните методи за идентифициране на вируса на птичия грип включват ELISA на базата на моноклонални антитела към хемаглутинин и вътрешни вирусни протеини NP и M, както и PCR с два вида праймери на основата на неструктурен протеин и хемаглутинин.
Ретроспективна диагноза. Въз основа на откриването на антихемаглутиниращи и свързващи комплемента антитела в сдвоени серуми. За тази цел се използват серологични тестове.
RTGA. Сдвоените серуми се изследват едновременно. Съхранявайте първата проба при 4 ° C или замразена. Преди реакцията серумът се освобождава от термолабилни и термостабилни инхибитори. Реакцията се провежда с диагностичен комплект, съдържащ 15 референтни вирусни щама.
Реакцията се счита за положителна, ако титърът на антителата във втората проба е поне 4 пъти по-висок от титъра на антителата към същия подтип на вируса в първата проба.
RSC се поставят или с местна бивша руска алантоисна течност, която предварително се избистря чрез центрофугиране, или с диагностичен комплект, съдържащ референтни вирусни антигени. Използват се както класическата техника, така и микрометодът, модифициран от В. В. Ритова.
RRH (радиална реакция на хемолиза) понастоящем се използва широко за имунологичен мониторинг с цел изследване на имунния фон и оценка на имунитета след ваксинацията. Когато се използват референтни вирусни антигени, е възможно да се получат ясни зони на радиална хемолиза с хомоложни антитела в изследваните серуми.
ELISA се провежда според варианта на твърда фаза, а вътрешният протеин (NP) на вируса на грип А. се използва като антиген за сенсибилизиране на ямките на диагностичните плочи. Титрите на антителата в ELISA са 5 или повече пъти по-високи отколкото в RSK.
Диференциална диагноза. Грипът трябва да се разграничава от нюкасълската болест, инфекциозния бронхит и ларинготрахеит и хемофилия и миксоплазмоза.
Имунитет и специфична превенция. Основната трудност при профилактиката на грипа се крие във вариабилността на външните протеини на вирусите, което води до появата на нови циркулиращи епизоотични щамове, различни от ваксините. Ето защо ранната, навременна и ефективна диагностика на нови щамове е спешна задача на ветеринарната медицина. За това се използва радиоимуноанализ (RIA).
За профилактика на инфлуенца по птиците, причинена от вируса H7N1 (класическа чума по птиците), се използват домашни живи ваксини от атенюирани щамове Ru и P5; за профилактика на заболяването, причинено от подтипове H1-H8, местните биофабрики произвеждат инактивирана ваксина с β-пропиолактон алуминиев хидроксид. В чужбина се използват жива невраминидаза-N-специфична ваксина (Англия), маслено-емулсионна ваксина за пилета-бройлери и кокошки носачки (САЩ). Разработен е метод за производство на рекомбинантен вирус на птичия грип, експресиращ вирусни протеини, който може да се използва като жива ваксина за домашни птици.