Гломерулен израстък като тест Ex Vivo за анализ на пътищата, включени в париеталната епителна клетка

Обобщение

Тази статия описва метод за култивиране и анализ на израстване на гломерулни париетални епителни клетки от капсулирани гломерули, изолирани от миши бъбрек. Този метод може да се използва за изследване на пътища, участващи в пролиферацията и миграцията на париеталните епителни клетки.

Резюме

Въведение

Гломеруларните заболявания са важна група бъбречни заболявания и са водеща причина за крайния стадий на бъбречно заболяване (ESRD) .За съжаление, специфичните възможности за лечение са ограничени и преходът към ESRD е неизбежен. Гломерулните заболявания се определят от наличието на гломерулни наранявания и могат да бъдат групирани в възпалителни и невъзпалителни заболявания. Въпреки че първоначалната обида е различна, последните проучвания показват, че общ клетъчен механизъм води до хиперплазия на гломерулни епителни клетки и в крайна сметка до гломерулосклероза при всички гломерулни заболявания, независимо от основната причина 1, 2, 3, 4 .

По-специално е показано, че гломерулосклеротичните лезии се състоят главно от активирани париетални епителни клетки 5, 6. При физиологични условия париеталните епителни клетки са плоски, спящи епителни клетки, които облицоват капсулата на Боуман на гломерула. Въпреки това, всяко гломерулно увреждане, дължащо се на генетични мутации (напр. Специфични за подоцити или митохондриални цитопатии), възпаление или хиперфилтрация (напр. Причинено от намалена бъбречна маса, високо кръвно налягане, затлъстяване или диабет мелитус) може да предизвика активиране на париеталните епителни клетки . Активираните париетални епителни клетки се размножават и отлагат извънклетъчен матрикс, което води до образуването на клетъчни полумаймуни или склеротични лезии 5, 7, 8. Напредването на тези процеси води до загуба на бъбречната функция 9. Следователно активирането на активирането на париеталните епителни клетки е ключов фактор за развитието и прогресирането на гломерулосклерозата при възпалителни и невъзпалителни гломерулни заболявания 1, 2, 3, 4, 10 .

Молекулните процеси, които медиират активирането на париеталните епителни клетки, все още са до голяма степен неизвестни. Последните проучвания показват, че активираните париетални епителни клетки de novo EXPRESS CD44, рецептор, който участва в активирането на различни пътища в клетъчната пролиферация и миграция. Освен това е показано, че инхибирането на CD44 инхибира активирането на активирането на париеталните епителни клетки и отслабва прогресията на образуването на полумесец и гломерулосклерозата при животински модели на възпалителни и невъзпалителни гломерулни заболявания 11, 12.

Тъй като активирането на париеталните епителни клетки е важен участник в развитието на гломерулосклероза и образуване на полумесец, инхибирането на тези клетки може да забави прогресията на гломерулните заболявания. Изясняването на молекулярните пътища, които задействат активирането на париеталните епителни клетки, може да доведе до разработването на специфични терапевтични интервенции, които отслабват образуването на хиперпластични и гломерулоклеротични лезии при гломерулни заболявания.

При експериментални животински модели често е трудно да се предоставят доказателства за директен ефект от променена генна експресия (нокаут модели или модели на трансгенни мишки) или за медикаментозно лечение върху париеталните епителни клетки. При конвенционална нокаутирана мишка наблюдаваните in vivo промени могат да бъдат обяснени с директни промени в париеталните епителни клетки. Тъй като обаче генната експресия се променя и при други клетъчни типове в рамките на мишката, не могат да бъдат изключени индиректни ефекти, медиирани от други клетъчни типове. Развитието на условни мишки Cre-Lox, задвижвани от промотори, които са предимно активни в париеталните епителни клетки, е осигурило решение за 13 в някои случаи. Въпреки това условните трансгенни модели са сложни и макар да стават достъпни повече условни линии, много от традиционните нокаутиращи или трансгенни линии на мишката все още не са условно заменени.

За да изследва директните ефекти върху париеталните епителни клетки, нашата група разработи ex vivo анализ, използвайки единични капсулирани гломерули, изолирани от бъбреците на мишка, за да измери и анализира пролиферацията и миграцията на париеталните епителни клетки. Този метод ще ни позволи да определим специфичните за париеталните епителни клетки ефекти и да намерим отговорни пътища за активиране на париеталните епителни клетки и да тестваме възможностите за лечение, за да инхибираме това активиране.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички експерименти с животни са проведени в съответствие с насоките на Комитета по етика на животните от университета Radboud Nijmegen.

ЗАБЕЛЕЖКА: Нелекувани, здрави мишки от див тип (n = 4) и cd44 -/- (n = 4) мишки бяха умъртвени на възраст от 12 до 16 седмици. Използвани са както мъжки, така и женски мишки. Всички мишки бяха на фона на C57Bl/6.

1. Жертвайте здрави WT мишки или генетично модифицирани мишки чрез цервикална дислокация.
2. Дисектирайте цели миши бъбреци веднага след жертването на мишките. За да направите това, направете средна лапаротомия с коремни ножици, изрежете кожата и след това коремните мускули. Извадете червата и го поставете до мишката.
3. Освободете бъбреците от присъединяване към тъканите и извадете бъбрека с хирургични клещи, изрежете бъбречната артерия, бъбречната вена и уретера с ножица.
4. Отстранете бъбречните капсули от бъбреците, като задържите бъбрека с хирургически форцепс и отлепете капсулата с друга двойка форцепс.
5. Пригответе бъбреците в 6-ямкова плоча за клетъчна култура (2 бъбрека/добре) с 2 ml балансиран солев разтвор на Von Hanks (HBSS) на кладенче и поставете върху лед.

2. Изолиране на гломерули от миши бъбрек

3. Култивиране на гломерулния израстък

4. Анализ на пролиферацията на париетални епителни клетки

5. Характеристика на растежа на гломерулните клетки

ЗАБЕЛЕЖКА: За да се оцени клетъчният състав на израстъка, се извършва имунофлуоресцентно оцветяване за клетъчно специфични маркери върху гломерулните израстъци при t = 6 дни.

1. Внимателно отстранете средата и внимателно измийте гломерулите два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).
2. Фиксирайте за 10 минути при стайна температура с 2% (w/v) параформалдехид (PFA), допълнен с 4% (w/v) захароза в PBS и внимателно измийте 2x с PBS.
3. С първичното антитяло с подходяща концентрация (Таблица с материали) Инкубирайте в PBS-овчи серумен албумин (BSA), разреден 1% (v/v) за 1 h при стайна температура.
4. Отстранете разтвора на антитялото и измийте внимателно 3 пъти с PBS.
5. Инкубирайте с вторично антитяло (Таблица с материали) разреден в PBS-BSA 1% (v/v) на тъмно в продължение на 45 минути при стайна температура.
6. Внимателно се измива 3 пъти с PBS и се сглобява с 1-2 капки водна среда за сглобяване с 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), за да се визуализират ядрата и да се покрие кладенецът с кръгъл капак.
7. Правете микроскопични снимки с флуоресцентен микроскоп.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Фигура 1: Схематичен преглед на метода за извършване на анализ на гломерулен израстък за анализ на пролиферацията на епителни клетки. (1) Бъбреците се дисектират от жертва на мишка и се смилат на малки парченца. (2) Бъбречната тъкан се прокарва през сито от 300 m и се изплаква през ситата от 75 m и 53 m. (3) Останалите на ситата гломерули се събират със средно + 20% (v/v) FCS и се прехвърлят върху свръхниска монтажна плоча. (4) Отделни гломерули се събират с обърнат светлинен микроскоп и се прехвърлят в 24-ямкови културални плаки. (5) След инкубация при 37 ° C, 5% (v/v) CO2 в продължение на 6 дни, гломерулният израстък може да бъде анализиран с цифров инвертиран светлинен микроскоп. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Фигура 2: Гломерулен израстък на изолирани капсулирани гломерули от бъбреци, дисектирани от WT мишки. Растежът на капсулирани гломерули, инкубирани при 37 ° C, е показан по различно време: (А.) 0 дни, (Б.) 2 дни, (° С.) 4 дни и (Д.) 6 дни. Декапитулираните гломерули също се изолират и култивират при 37 ° С и се правят микроскопични изображенияДен0 и (F.) Ден 6, който не показва нарастващи клетки. Мащабна лента: (A, E, F) 200 'm, (Б.) 400 'm, (CD) 1000 'm. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Фигура 3: Растящите гломерулни клетки показват експресията на маркера на париеталните епителни клетки. Имунофлуоресцентното оцветяване се извършва на 6-ия ден след изолиране на отделни капсулирани гломерули, за да се характеризират обраслите епителни клетки. Прерастващите клетки, оцветени положително за маркери на париетални епителни клетки: (А.) CD44, (Б.) SSeCKS и (° С.) клаудин-1, но не показва израз на (Д.) специфичния за подоцитите маркер синаптоподин или (Д.) специфичният за ендотелните клетки маркер CD31, който се намира изключително в гломерула. Мащабна лента: (A, B, D, E) 100'м, (° С.) 50 'm. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Фигура 4: Гломерулният растеж е нарушен при гломерули, изолирани от CD44 мишки с нокаут. Капсулирани гломерули са получени от дисектирани бъбреци от (А.) WT мишки и (Б.) cd44 -/- изолирани мишки. Микроскопските изображения са направени след 6 дни в култура с цифров инвертиран светлинен микроскоп. Броят на израстващите париетални епителни клетки и повърхността на израстъка са увеличени в гломерулите на WT мишки в сравнение с cd44 -/- мишки, което показва важна роля за CD44 в активирането на париеталните епителни клетки. Мащабна лента: 1000 m. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Фигура 5: Пример за анализ на повърхността на гломерулния израстък като маркер за пролиферация на париетални епителни клетки с ImageJ (FIJI). (А.) Гломерулен израстък на капсулиран гломерул на WT мишка след 6 дни в култура при 37 ° C. (Б.) Първо се определя скалата, за да се анализира повърхността в mm 2. Тук: 1 mm = 460 пиксела. (° С.) След задаване на скалата се изчертава селекционна линия около зоната на гломерулния израстък. (Д.) Тази избрана площ след това може да бъде измерена (повърхността в този пример = 2 235 mm 2). Мащабна лента: 1000 m. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Протоколът, описан в тази статия, може да се използва за използване на отделни капсулирани гломерули за оценка на пролиферацията на париетални епителни клетки, която е следствие от активирането на париеталните епителни клетки. Този ex vivo модел ще ни позволи да проучим подробно молекулярните пътища, участващи в активирането на париеталните епителни клетки. Описаният метод се основава на простата концепция за дисекция и пресяване на бъбреците за изолиране и култивиране на капсулирани гломерули и за сравняване на пролиферацията и/или миграцията на париетални епителни клетки при различни експериментални условия. Резултатите, които могат да бъдат анализирани след 6 дни в културата, са например повърхностната площ или диаметърът на израстъка или броят на израстващите клетки на единичен капсулиран гломерул. Друго приложение за този тест може да бъде изучаването на ефектите на лекарства, които индуцират или инхибират молекулярни пътища, които могат да участват в активирането на париеталните епителни клетки.

Имунофлуоресцентното оцветяване потвърждава, че израстващите клетки са париетални епителни клетки след 6 дни в културата, тъй като са оцветени положително за маркери на париеталните епителни клетки (CD44, клаудин-1, SSeCKS), но не изразяват нито специфичния за подоцитите маркер синаптоподин, нито ендотелния клетъчен маркер. В съответствие с резултатите от оцветяването, не могат да се наблюдават израстващи клетки 6 дни след изолирането и култивирането на отделни декапсулирани гломерули, което предполага, че има ограничено замърсяване на други гломерулни клетки в израстъка в рамките на този 6-дневен период. Друго проучване също анализира гломерулния израстък и показва, че бързорастящите клетки, получени от гломерулен израстък, всъщност са получени от париетални епителни клетки 14.

Протоколът за оцветяване, използван за анализ на експресия на маркер на израстващите клетки, може да бъде адаптиран и към други молекули, които представляват интерес. Имунооцветяването се извършва в ямките на плаките, в които гломерулите се инкубират в продължение на 6 дни. Тези кладенци не бяха покрити през първата 2-3 часа инкубация, но гломерулите бяха прикрепени към ямките. Инкубацията върху стъклени вложки или плъзгаща се камера, което би довело до по-добро изобразяване, не беше възможна, тъй като гломерулите не бяха напълно прикрепени към повърхността и гломерулният израстък беше нарушен. Този специфичен протокол беше създаден наскоро за изследване на растежа на париетални епителни клетки от гломерули от здрави WT и cd44 -/- мишки 11. С този метод беше показано, че CD44-дефицитните париетални епителни клетки имат намалена скорост на пролиферация, което също е показано на Фигура 4ще се покаже. Този метод може да се използва и за мишки от други щамове, както и за други генетично модифицирани мишки. Например, предишно проучване използва подобен подход за анализ на ефектите от сигнализирането на глюкокортикоидните рецептори 15.

Използването на тази техника за изолиране на гломерули от мишки и анализ на клетъчните израстъци има много предимства пред използването на увековечени париетални епителни клетъчни линии за анализ на пътищата, участващи в активирането на париеталните епителни клетки или лекарства, които предотвратяват процеса на Може да повлияе на пролиферацията на епителните клетки. На първо място, този метод използва първични клетки, които растат директно от гломерула и са в културата само за 6 дни. Следователно, париеталните епителни клетки от гломерулни израстъци претърпяват по-малко промени във фенотипа, отколкото вечните клетъчни линии, които изискват допълнителни пасажи за растеж, за да се получи клетъчна линия 16. В допълнение, методът, описан тук, може да се използва за сравняване на ефекта от специфични генни нокаути върху пролиферацията на париетални клетки, също и за пътища, които е трудно да се заглушат в клетъчни линии поради нарушен клетъчен растеж или ефективността на GenKnockout, използвайки методи за заглушаване.

За да се адаптира протокола към други животински модели или към човешка бъбречна тъкан, размерът на ситата трябва да бъде оптимизиран за най-добър резултат. Това е така, защото гломерулният размер се различава между видовете и следователно размерът на ситата, на които могат да се събират гломерулите, варира. Също така е важно да се изолират непокътнати, капсулирани гломерули за целите на този метод. Следователно гломерулите не трябва да се изстискват, а внимателно да се изплакват през по-малките сита.

Друга важна стъпка в протокола е събирането на капсулираните гломерули след пресяването. Тук е важно да се използва среда с 20% FCS, за да се избегне прикрепването на гломерулите един към друг. В допълнение, разтворът, обогатен с гломерули, трябва да се прехвърли директно върху свръхниски адхезивни плочи, в противен случай гломерулите ще бъдат прикрепени директно към повърхността на обикновените плочи за клетъчни култури и дори към повърхността на пластмасовите тръби, което затруднява откриването и изолирането на отделни гломерули.

След събиране на отделни капсулирани гломерули, те трябва да се култивират в продължение на 3 часа в малък обем от хранителната среда в центъра на ямката, за да се осигури адхезия. Гломерулите не трябва да се носят по посока на дъската на кладенците, за да оптимизират отчитането по време на анализа на изображението.

За да постигнете най-добри резултати с описания тук протокол, препоръчваме култивиране на отделни гломерули и извършване на отчитането на ден 6. В този момент от време може да се наблюдава хомогенен клетъчен израстък, състоящ се от париетални епителни клетки. По-късно гломерулният израстък става фенотипично хетерогенен, което предполага растеж на други клетъчни типове. Следователно протоколът не изглежда подходящ за много дълги времена на инкубация. Трябва да се отбележи, че инкубационното време за израстване на париетални епителни клетки може да варира между видовете или между различните миши щамове. Следователно, времето за култивиране трябва да бъде тествано и оптимизирано за всеки щам или вид мишка. Освен това произходът на гломерулния израстък винаги трябва да се потвърждава чрез оцветяване за специфични маркери за париетални епителни клетки.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

---