УНИВЕРСИТЕТНА КЛИНИКА ХАМБУРГ-ЕПЕНДОРФ - PDF безплатно изтегляне

УНИВЕРСИТЕТНА КЛИНИКА ХАМБУРГ-ЕПЕНДОРФ Институт за клетъчна и интегративна физиология към Центъра за експериментална медицина проф. Д-р мед. Heimo Ehmke Роля на WNK киназите в регулирането на електролитния транспорт в дисталния нефрон на нокаутираната мишка BKβ1 Дисертация За получаване на степен доктор по дентална медицина в Медицинския факултет на Хамбургския университет, представена от Анелен Дитмер от Buchholz i.d.n. Хамбург 2013

университетна

Прието от Медицинския факултет на Хамбургския университет на: 13 май 2014 г. Публикувано с разрешение на Медицинския факултет на Хамбургския университет. Изпитна комисия, председател: проф. Д-р мед. H. Ehmke изпитна комисия, втори рецензент: PD Dr. обратно нат. E. Schwedhelm Examination Board, трети рецензент: PD Dr. мед. В. Майер-Швезингер

Съдържание Съдържание 1. Въведение 7 1.1 Артериална хипертония във връзка с приема на натрий. 7 1.2 Натриеви и калиеви транспортни системи в бъбреците 9 1.3 Синдром на Гордън: Откриване на ролята на WNK киназите в регулирането на кръвното налягане. 17 1.4 WNK киназите.18 1.5 Ефекти на WNK киназите върху електролитния баланс. 20 1.6 Цел и подход в работата. 25 2. Материал и методи. 27 2.1 Материал 27 2.1.1 Общо лабораторно оборудване 27 2.1.2 Консумативи. 29 2.1.3 Химикали. 30 2.1.4 Ензими 31 2.1.5 Биохимикали 32 2.1.6 Комплект . 33 2.1.7 Разтвори, буфери 33 2.2 Методи. 36 2.2.1 Калиева диета на животните. 36 2.2.2 Защитни мерки за изолиране на РНК. 37 2.2.3 Дисекция на бъбреците и изолиране на РНК на бъбречната зона. 37 2.2.4 Измерване на OD на изолирана бъбречна РНК. 39 2.2.5 Измерване на Agilent на изолирана бъбречна РНК. 39 2.2.6 Микродисекция 40 2.2.7 РНК изолиране на нефроновите тубули. 41 2.2.8 Обратна транскриптаза (RT) . 42 2.2.9 Актин-PCR.43 4

Съдържание 2.2.10 Електрофореза в агарозен гел.44 2.2.11 PCR в реално време.44 2.2.12 Статистика. 49 3. Резултати 51 3.1 Сравнение на мишки от нокаут от див тип и BKβ1 51 3.1.1 Резултати от PCR анализ в реално време на кората на кората . 51 3.1.2 Резултати от PCR анализ в реално време на микродисекцията Резултати от калиевите диети. 58 3.2.1 Луминалният натриев транспортер NCC и епителният натриев канал ENaCβ на калиева диета 58 3.2.2 Апикалният калиев канал ROMK на калиева диета 61 3.2.3 WNK киназите на калиева диета 62 3.2.4 Киназата SGK1 и протеинът GRP58 на калиевата диета. 64 3.2.5 Протеиновият CHIF на калиева диета 66 3.2.6 Транспортерът NKCC2 на калиева диета. 67 4. Дискусия 68 4.1 Мотивация на въпроса 68 4.2 Мишки от див тип на калиева диета ... 69 4.2.1 Натриево-хлоридният транспортер (NCC) 72 4.2.2 Епителният натриев канал (ENaC). 72 4.2.3 Луминалният калиев канал ROMK 73 4.2.4 Поведение на киназите 75 4.2.5 Други възможни алдостеронови цели 79 4.3 Сравнението на нокаутираните мишки от див тип и BKβ1. 82 4.3.1 Резултати от PCR в реално време при нормална диета 82 4.3.2 Резултати от микродисекцията 84 4.4 BKβ1 нокаутиращи мишки на калиева диета ... 85 5

Съдържание 4.4.1 Диета с ниско съдържание на калий при нокаутираните мишки BKβ1. 85 4.4.2 Диета с високо съдържание на калий при нокаутиращи мишки BKβ1 . 88 4.5 Outlook. 90 5. Резюме 93 6. Списък на съкращенията. 94 7. Списък на фигурите. 98 8. Списък на таблици. 101 9. Библиография. 102 10. Благодарности. 119 11. CV. 120 12. Декларация . 121 6

Материал и методи 2. Материал и методи 2.1 Материал 2.1.1 Общи лабораторни устройства Таблица 1а: Използвани общи лабораторни устройства Обозначение на типа на устройството Баланс за анализ на предприятието ISO 9001 Sartorius AG, автоклав в Гьотинген 3850 ELC Tuttnauer Systec Ltd., Ню Йорк, САЩ Биоанализатор тип 2100 Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ Електрофорезно захранване EPS 600 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Стъклена пипета Пипетна батерия Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co KG, Eberstadt Електрофорезна камера Polytron хомогенизатор PCR устройство Тиристорен контролер TR50 Gene Amp PCR System 2400 Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, САЩ Perkim Elmer, Norwalk CT, USA ph-метър ph-метър 320 Mettler-Toledo GmbH, Giessen Photometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Pipettes Pipetman P2, P10, P20, P200, P1000 Gilson, Middleton, WI, USA 27

Материал и методи Таблица 1b: Използвано общо лабораторно оборудване Обозначение на типа устройство Фирма Прецизни везни 440-33N Gottl. Kern & Sohn GmbH, Balingen - Frommern PCR устройство в реално време Light Cycler гъска врата KL 1500 LCD Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Schott AG, Mainz Speed ​​Vac Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg Thermoblock TB1 Biometra GmbH, Göttingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg Ултравиолетова маса - Biometra GmbH, Göttingen Vortexer MS2 Minishaker Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Центрифуга Centrifuge 5417C Eppendorf GmbH, Hamburg Centrifuge 5417R Biofuge pico Biofuge stratos Eppendorf GmbH, Hamburg Heraeus Instruments GmbH, Heeero Instruments GmbH Остерод 28

Материал и методи 2.1.2 Консумативи Таблица 2: Използвани консумативи Материал Обозначение на продукта Фирма Пипета за изпускане Серологична пипета 10 ml Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA Накрайници за безопасно запечатване: 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Biozym Biotech Trading GmbH, Виена, Австрия Микрореакционни съдове 1,5 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 2 ml Sarstedt AG, Nümbrecht PCR капиляри в реално време PCR тръби 0,2 ml Safe-Lock епруветки 0,5 ml за Agilent Light Cycler Capillaries (20 µl) Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tubes Cellstar 50 ml Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster, Австрия Центрифужни епруветки Тръби 4 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 29