Третиран от цефоперазон миши модел на клинично значим щам Clostridium difficile R20291

Обобщение

Този протокол описва миши цефоперазонов модел на инфекция с Clostridium difficile (CDI), използващ клинично значим и генетично лечим щам, R20291. Акцентът върху клиничното наблюдение за C. болест, трудното изброяване на бактерии, цитотоксичността на токсините и хистопатологичните промени в CDI в миши модел са подробно описани в протокола.

Въведение

Clostridium difficile е анаеробен, Грам-положителен спорообразуващ бацил, който причинява животозастрашаваща диария 1. C. difficile инфекцията (CDI) е свързана с повишена заболеваемост и смъртност при хората и води до над 4,8 $ 1-4 милиарда разходи за здравеопазване на година. През 2013 г. Центровете за контрол и превенция на заболяванията категоризираха C. difficile като спешен риск за антибиотична резистентност, което показва, че представлява спешна заплаха за общественото здраве 1. В момента антибиотичното лечение ванкомицин и метронидазол се считат за стандартни грижи за CDI 5 За съжаление, повтарянето на CDI след успешно лечение с антибиотици е високо, което се наблюдава при 20 - 30% от пациентите 2,5-7. Следователно е необходимо откриването на нови терапевтични агенти срещу този ентеричен патоген. За да се оцени терапията срещу C. difficile, е необходим животински модел, приближаващ се до човешко заболяване с АС, линеен релевантен щам.

Първо, постулатите на Кох са установени за C. difficile през 1977 г., използвайки третиран с клиндамицин модел на сирийски хамстер 8. Този модел се използва и до днес за изследване на ефектите на токсините на C. difficile върху патогенезата. 9.10. Въпреки това, CDI в модела на хамстер води до високи нива на смъртност и не се доближава до хроничните коварни прояви на болестта, които могат да се наблюдават при хора с CDI 10,11. Въз основа на достъпността и наличността на отзивчиви платформи за мишка при търсене на модел на мишка CDI е от значение.

През 2008 г. беше създаден стабилен модел мишка на CDI чрез третиране на мишки с коктейл от антибиотици в питейна вода (канамицин, гентамицин, колистин, метронидазол и ванкомицин) в продължение на 3 дни, последвано от интраперитонеална инжекция на клиндамицин 12. Тази мишка направи податливи на CDI и тежък колит. В зависимост от приложената доза инокулум, могат да се наблюдават редица клинични признаци и леталност, използвайки този модел. Оттогава са проучени различни антибиотични лечения, които модифицират микробиотата на мишите черва, намалявайки устойчивостта на колонизация до точката, в която C. difficile може да колонизира стомашно-чревния тракт (прегледано в Best et al. И Lawley & Young) 13.14.

Съвсем наскоро широкоспектърният цефалоспорин, цефоперазон, даван в питейна вода в продължение на 5 или 10 дни, прави мишките податливи на CDI възпроизводими 15. Тъй като приложението на трето поколение цефалоспорини е свързано с повишен риск от CDI при хората, употребата на цефоперазон моделът отразява по-отблизо естествено срещащата се болест 16. Лекуваните с цефоперазон мишки, податливи на C. difficile, се предизвикват както със спори на C. difficile, така и с вегетативни клетки от различни клинични щамове, вариращи по значимост и вирулентност 17. Въпреки някои от първоначалните проучвания, използващи вегетативни клетки на C. difficile, инфекциите, спорите на C. difficile са счита за основен начин на предаване 18.

През последното десетилетие се появи C. difficile R20291, a/BI/027 щам NAP1, причиняващ епидемии от CDI 19,20. Опитахме се да определим клиничния ход на заболяването, когато мишките, лекувани с цефоперазон, са били изложени на клинично значимия и генетично лечим щам C. difficile, R20291. Този протокол подробно описва клиничното протичане, включително загуба на тегло, бактериална колонизация, токсичност на токсините и хистопатологични промени в стомашно-чревния тракт на мишки, заразени със спори на C. difficile R20291. Като цяло този модел на мишка се оказва ценна експериментална платформа за CDI, приближаваща се към човешките заболявания. Следователно този характеризиран модел на мишка може да се използва за оценка на ефектите на новите терапевтични средства върху облекчаването на клиничното заболяване и върху възстановяването на резистентност към колонизация срещу C. difficile.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Етично изявление:
Институционалната комисия за грижи и употреба на животните (IACUC) към Държавния университетски колеж на Северна Каролина по ветеринарна медицина (NCSU) одобри това проучване. Политиката на NCSU за грижи и употреба на животните прилага стандартите и насоките, определени в Закона за удължаване на лабораторните условия за хуманно отношение към животните и здравето от 1985 г. Съоръженията за домашни любимци в NCSU се придържат към указанията, посочени в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни. Здравни условия Животните се оценяват ежедневно и умиращите животни са хуманно евтаназирани чрез задушаване на CO2, последвано от вторични мерки. обучени техници по животни или ветеринарен лекар са извършили развъждане в акредитирано заведение AAALAC по време на това проучване.

1. Прилагане на антибиотика цефоперазон в питейна вода за постигане на чувствителност към C. difficile Колонизация и болести

ЗАБЕЛЕЖКИ:/6 WT мишки на възраст от 5 до 8 седмици C57BL (женски и мъжки) са закупени и поставени под карантина за 1 седмица преди началото на приложението на антибиотична вода. След карантина мишките бяха настанени с автоклавирана храна, постелки и вода. Смяната на клетката се извършва ежеседмично от лабораторен персонал в качулка с ламинарен поток.

  1. Пригответе цефоперазон (0,5 mg/ml) в стерилна дестилирана вода 7 дни преди целевия ден на предизвикване (Фигура 1).
  2. Напълнете автоклавираните бутилки с вода с цефоперазонова вода (0,5 mg/ml) и ги поставете във всяка клетка на мишката.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Прясно приготвената вода от цефоперазон трябва да се прави и сменя на всеки 2 дни за период от 5 дни, както е отбелязано в стъпки 1.1 и 1.2. Препоръчва се подходящо изхвърляне на цефоперазонова вода в съответствие с институционалните насоки за здраве и безопасност на околната среда.
  3. След 5 дни на цефоперазонова вода, заменете бутилките с автоклавирани бутилки с вода, пълни със стерилна дестилирана вода. Дайте на мишката и питейна вода по време на експеримента.

2. Приготвяне на инокулум от спори на C. difficile и сонда на мишки

ЗАБЕЛЕЖКА: Преди да започнете, уверете се, че в анаеробната камера за най-малко 24 часа се поставят: 1x фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; вж. Материали), циклосерин таурохолат цефокситин фруктозен агар (TCCFA) плочи (вж. Материали и допълнителния файл), и стерилно L-образно прибиращо устройство.