Тест за изтичане на базата на протеолипозома за определяне на едномолекулни свойства на Cl-канали и
Въведение
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
1. Приготвяне на липиди
2. Образуване на протеолипозома
ЗАБЕЛЕЖКА: Няколко стратегии могат да бъдат използвани за въвеждане на разтворим в детергента протеин в липозомите. За CLC-ec1 диализата работи добре и следователно е избраният метод 6,9,10.
3. Настройка на записа
ЗАБЕЛЕЖКА: Регистрацията е настроена (фигура 2А) се състои от две камери (цилиндри с плоско дъно,
3-4 ml обем), Cl - (виж по-долу) електрод, pH-метър с аналогов или цифров електрически изход, дигитайзер и компютър с подходящ софтуер за придобиване.
- Свържете електрода Cl - pH метър, изхода на pH метъра към дигитайзера, който е свързан към компютъра. Поставете референтния електрод в едната камера за прекодиране, а жицата в другата (фигура 2Б).
ЗАБЕЛЕЖКА: Полярността на проводниците е правилна, ако AV Cal (вижте стъпки 6.4 и 7.2) е положителна. - Поставете камерите върху разбъркваща плоча с бъркалка в записващата камера (фигура 1Б). Уверете се, че бъркалката не докосва електрода.
- Свържете камерите с помощта на агар мост (фигура 2Б) (100 mM KCI и 2% агароза). Съхранявайте Agar Bridges в 100 mM KCl.
4. Приготвяне на Cl - електрод
- Вземете стар и вероятно неработещ pH електрод. Счупете стъкленото покритие, за да разкриете напълно сребърните нишки.
- Внимателно отстранете покритието от сребърните проводници с помощта на острие на скалпел. Почистете проводниците, като използвате големи количества H 2 O и EtOH.
- Поставете в наситен разтвор на FeCl 3 (или белина), докато проводниците се покрият с еднородна тъмна обвивка на AgCl.
5. Подготовка на еднопластови везикули
-
Вечер преди експериментите, надуйте 1 g топчета Sephadex G-50 в 15 ml външен буфер (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM лимонена киселина, pH 4.5) с леко разклащане. (Не разбърквайте) за поне три часа при стайна температура преди употреба. Всеки опит изисква
3 мл подути перли. Дръжте мънистата подути при 4 ° C най-много няколко дни. Докато липозомите се размразяват при стайна температура, изсипете във всяка колона
3 мл надути мъниста G-50. Оставете ги да изсъхнат гравитационно при стайна температура; обикновено отнема 1-2 минути.
200 фута акредитиви, които ще бъдат добавени към камерата за запис в стъпка 6.5.
6. Измерване на ефлукса
- Поставете 2 ml от 100 mM KCl в еталонната (масова) камера и 1,8 ml от външния буфер (1 mM KCl, 150 mM K2S04, 25 mM лимонена киселина при рН 4,5) в камерата за запис. Лекият осмотичен дисбаланс между вътрешни и външни решения не влияе
- Стартирайте програмата за придобиване. Оставете базовия баланс, може да отнеме няколко минути.
- След като сигналът достигне стабилна базова линия (липозомите са готови и колоните изсъхнат), започнете да записвате (фигура 3А).
- Добавете 15 µl от 10 mM разтвор на KCl, за да калибрирате системата (фигура 2А).
- Добавете липозоми. Малък скок може да се види поради непълно отстраняване на външните Cl - протеолипозоми (фигура 3А). Изчакайте базовата линия да се стабилизира.
- Добавете валиномицин (1 µl при 1 mg/ml в EtOH), за да започне изтичане (фигура 3А).
- Оставете изтичането да следва еволюцията си с течение на времето, докато достигне плато (фигура 3А).
- Добавете 40 µl 1,5 М β-октилглюкозид (β-OG), приготвен във външния буфер, за да се разтворят всички липозоми (фигура 3А). Пълна регистрация.
7. Анализ на данни
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
1/3 съдържа липозоми 0 активни протеини. От тези стойности изчисляваме, че единичната скорост на транспорт е γ
2500 Cl - сек -1, в добро съгласие с публикувани стойности 8.14.
