Тест за бащинство Анатомия и физиология
Тестът за бащинство е генетичен тест, който определя дали дадено лице е биологичен баща на дете или не. Генетичното доказателство за бащинство е много полезно, особено в съдебната медицина. Съществуват и тестове за майчинство, много по-рядко използвани, които се изискват особено в случаи на отпуск по майчинство, детеубийство или осиновяване. В миналото са били използвани различни методи за установяване на бащинство, като анализ на антиген на кръвна група, анализ на HLA антиген, анализ на левкоцитни антигени или анализ на различни протеини и ензими, но всички те не осигуряват надеждни резултати.
Дефиниция на тест за бащинство
Тестът за бащинство е лабораторният анализ на 16 ДНК последователности, разположени върху различни хромозоми, за да се установи сигурността, че дадено лице е биологичен баща на детето. Изискват се биологични проби от предполагаемия баща и детето, като се анализират 16 маркера или ДНК последователности от всеки, като ДНК анализът е единственият, който осигурява сигурност при определяне на степента на родство. Пробите, получени от двете индивиди, се сравняват чрез анализ на всеки маркер поотделно и установяване на взаимно допълване между маркерите от детето и маркерите от бащата. Ако се вземат и проби от майката, степента на специфичност на теста ще се увеличи, но това не е непременно необходимо, като тестът има специфичност 99,9% и в случай на събиране на две проби, една от предполагаемия баща и една от дете. Тестът може да се направи както преди, така и след раждането.
В Румъния разходите за тест за бащинство са между 750 (тества се майка, предполагаем баща и 1 дете) и 1500 RON (тества се майка, двама предполагаеми бащи и две деца), в зависимост от метода на теста, събраната биологична проба и броя на анализираните проби.
Резултатът е достъпен след 3 - 7 работни дни от изпращането на тестовете в лабораторията, но може да отнеме дори повече време, в зависимост от техниката, използвана от лабораторията, извършваща анализа.
Може и да се определи братство (родство между 2 или повече деца) и определяне на степента на родство между детето и различни членове на семейството (лели, чичовци, баби и дядовци). Той може също така да установи ДНК профила на индивида, и двете ядрен ДНК профил и също Митохондриална ДНК както и Y хромозомно тестване за установяване на родство между лица от мъжки пол (родство по бащина линия).
Тестване на двойна зигоза се извършва по същите методи като теста за бащинство и може да определи дали близнаците са монозиготни (идентични) или дизиготни.
Пренатално тестване
1. Амниоцентеза.
2. Биопсия на хорионни ворсинки.
Позволява ранни тестове, започвайки със седмици 10-13 от бременността. Тя включва събиране на малка част от плацентата от матката. Това е инвазивна процедура, която може да се извърши трансцервично (подход от влагалището, преминаване през шийката на матката до матката) или трансабдоминално с помощта на фина и тънка игла, под ехографско ръководство. Хориалните вили са фини тъканни израстъци в пръста на ръкавицата, изпъкнали от маточната стена. Те имат генетичен материал, идентичен с генетичния материал на плода. Усложненията са представени чрез трансвагинално кървене след процедурата и разкъсване на плацентарните мембрани. За теста е необходимо да се съберат 2-3 мм тъкан.
И амниоцентезата, и биопсията на хорионните вили са рутинни тестове, които се извършват пренатално не само за установяване на бащинство, но и за определяне на аномалии на генетичния материал и за установяване на диагнозата на генетични заболявания и хромозомни аномалии, диагноза, която може да бъде избрана за аборт терапевтичен). Биопсията на хорионните вили има предимството в това отношение, тъй като може да се извърши по-бързо, започвайки от 13-та седмица на бременността. Прибирането на реколтата, както в случай на амниоцентеза, така и в случай на биопсия на хорионни вили, ще се извършва само от гинеколога и само под ехографско ръководство.
3. SNP микрочип (микрочип с един нуклеотиден полиморфизъм)
е неинвазивна технология за определяне на бащинството чрез анализ на циркулираща фетална ДНК, извлечена от майчината кръв. Тестът може да се извърши, започвайки от 10 седмица на бременността. Анализират се ДНК на плода, ДНК на майката и ДНК от предполагаемия баща. 317 000 генетични маркери, представени от нуклеотиди, се анализират и бащинството се установява въз основа на тяхната комплементарност. Точността на този тест е 99,9% и има тенденция да замести инвазивните тестове като амниоцентеза и биопсия на хорионни вили.
Постнатално тестване
Задължителните проби за извършване на анализа са тези, взети от детето и предполагаемия баща. Не е задължително да се тества проба от майката, но нейното присъствие увеличава сигурността на резултата и вероятността за потвърждение на бащинството.
Методи за изпитване
1. Реакция на верижна полимеризация
PCR техника
Това е методът, чрез който ДНК последователност се усилва in vitro. Естествената ДНК претърпява процеса на репликация или синтез, при което се синтезира нова ДНК последователност с помощта на майчина ДНК последователност, наречена матрица. PCR извършва репликация на ДНК в лабораторията. Това води до по-големи количества от дадена ДНК последователност, които след това могат да бъдат анализирани. За реакцията са необходими:
- ДНК пробите, които трябва да бъдат анализирани (от предполагаемия баща, майка и дете), които ще бъдат приложени (наречена шаблонна ДНК)
- ДНК полимераза
- праймери (олигонуклеотиди)
- реакционен буфер
- Магнезиеви йони
Реакцията включва термична денатурация на ДНК матрицата с освобождаване на двойната спирала, свързване на праймерите и полимеризация. В края на първия цикъл на полимеризация (амплификация) се получава двойно количество ДНК в сравнение с количеството на ДНК-матрица. Извършват се между 25 и 40 цикъла на усилване. Минималното количество шаблонна ДНК за успеха на реакцията е 500 нанограма ядрена ДНК. Използваните праймери са изкуствени и трябва да допълват 5 'и 3' края на ДНК региона, за да бъдат амплифицирани. ДНК полимеразата, използвана за реагенти, се получава от термофилни микроорганизми и трябва да бъде термостабилна, за да издържа на температурите, при които протича реакцията на верижна полимеризация (100 градуса по Целзий). Най-често се използва ДНК полимераза Taq, или Taq Pol, получени от микроорганизма Termus Aquaticus. Taq Pol издържа и на трите температурни диапазона, при които се извършва PCR, а именно: 90-95 градуса по Целзий за денатуриране на ДНК на шаблона и разгъване на двойната спирала, 55-60 градуса за прикрепване на праймери към всяка от двете вериги на денатурирана ДНК на матрицата и 72-75 градуса за реакцията на полимеризация.
Етапи на верижната реакция на полимеризация:
а. Денатурация на двуверижна ДНК
Изработва се при температура над 90 градуса, в продължение на 20-30 секунди, с разглобяването на двуверижна ДНК на две взаимно допълващи се матрични вериги, към които след това ще бъдат прикрепени праймерите. Следователно, в края на този етап, две свободни едноверижни ДНК вериги ще доведат до реакционната среда.
б. Свързване на едноверижни ДНК праймери
Продължава 20-40 секунди, като през това време температурата се понижава до 55-60 градуса. Резултатът е хибридна двуверижна ДНК.
в. Удължаване на грундове
ДНК полимеразата ще се свърже с хибридната двуверижна ДНК верига, като прочете последователността на матричната ДНК верига и ще удължи праймерите въз основа на правилото за комплементарност между азотни основи.
Фази на усилване:
- Експоненциално усилване - удвояване на количеството ДНК в края на всеки цикъл на полимеризация
- Изравняване - Когато реагентите се консумират, реакциите ще протичат по-бавно
- плато - изчерпване на реагентите
2. Полиморфизъм на дължина на фрагмент с ограничение
Техниката включва фрагментиране на ДНК последователност с помощта на рестрикционни ензими. Получените фрагменти се разделят според дължината им чрез електрофореза в агарен гел и след това се прехвърлят в специална мембрана чрез процедурата Southern Blot. Всички проби от майката, предполагаемия баща и детето се анализират по един и същ метод и се сравняват според комплементарността на ДНК последователностите с еднаква дължина. RFLP методът се счита за златен стандарт за генотипиране, но е ограничен от факта, че ДНК на пробите, влизащи в теста, трябва да бъде с изключително качество, за да може да бъде разделена на фрагменти. Продължителността на теста също е много дълга, варираща между 3 седмици и 3 месеца, докато PCR тестът трае между 3 и 9 дни.
Тестът за бащинство представлява единственият метод да се премахне несигурността относно установяването на биологичния баща на дете, като е генетичен тест със 100% точност при елиминиране на лица, които не отговарят на статуса на биологичен баща и 99,9% точност при определяне на индивида с биологичен баща. Резултатът се издава след около седмица след получаване на пробите, но дори в Румъния има лаборатории, които работят в авариен режим, изпращайки резултата след 8 часа.