Създаване и анализ на нокаутирани модели на мишки на σ1 субединиците на комплекса AP-1 - PDF
Създаване и анализ на нокаутирани модели на мишки на σ1-субединиците на комплекс AP-1 Дисертация за получаване на докторска степен на математически-природни факултети на Georg-August-Universität zu Göttingen, представена от Jennifer Baltes от Saarbrücken Göttingen 2008
D7 Лектор: проф. Д-р К. фон Фигура Институт по биохимия II, Център по биохимия и молекулярно-клетъчна биология към Университета Георг-Август в Гьотинген Съпредседател: проф. Д-р Институт по микробиология и генетика на R. Ficner към Georg-August-Universität zu Göttingen. Ден на устния изпит: 22 януари 2008 г.
Съдържание I Съдържание 1. Въведение. 1 1.1 Везикуларен транспорт. 1 1.1.1 Клатрин. 4 1.1.2.1 AP-1 опосредствано образуване на везикули. 11 1.1.2.2 Мотиви за разпознаване на протеинови адаптери. 13 1.1.2.3 Взаимодействия на AP-1 с допълнителни протеини. 16 1.1.3 GGA адаптери. 19 1.1.4 Транспорт, опосредстван от AP-1. 22 1.2 Нокаутиращи модели на мишката на AP-1 Adaptine. 25 1.2.1 Фенотип на γ-нокаутираните мишки. 25 1.2.2 Фенотип на µ1 нокаутираните мишки. 26 1.2.3 Фенотип на нокаутираните мишки σ1b. 26 2. Въпрос. 28 3. Материал и методи. 29 3.1 Често използвани решения и устройства. 29 3.1.1 Буфери. 29 3.1.2 Културни среди. 29 3.1.3 Устройства. 30 3.1.4 Центрофуги и ротори. 30 3.2 Молекулярни биологични методи. 31 3.2.1 Изолиране на геномна ДНК от биопсии на опашката. 31 3.2.2 Утаяване на ДНК с етанол. 31 3.2.3 Фенол-хлороформ екстракция на ДНК. 32 3.2.4 Изолация на РНК от тъкани. 32 3.2.5 Количествено определяне на нуклеиновите киселини. 33 3.2.6 PCR. 33 3.2.6.1 PCR подход за генотипизиране на σ1b -/- - мишки. 35 3.2.6.2 PCR за генотипизиране на σ1a мишки за генен капан. 36 3.2.7 Ограничено смилане на ДНК. 38 3.2.8 Разделяне на ДНК чрез гел електрофореза върху агарозни гелове. 38 3.2.9 Екстракция на ДНК от агарозни гелове. 40 3.2.10 Лигиране на ДНК фрагменти. 41
Съдържание III 3.5 Протеинови биохимични методи. 58 3.5.1 Извличане на протеини от цели клетки от клетки. 58 3.5.2 Производство на тъканен хомогенат. 58 3.5.3 Определяне на протеин според Брадфорд. 59 3.5.4 Електрофореза в полиакриламиден гел (SDS-Page) съгласно Laemmli. 59 3.5.5 Трансфер на протеин към нитроцелулоза (Western blot). 62 3.5.5.1 Полусухо петно. 63 3.5.5.2 Мокро петно. 63 3.5.5.3 Имунооцветяване върху мембрани от нитроцелулоза/PVDF. 64 3.6 други методи. 66 3.6.1 ELISA за измерване на серумни концентрации на различни адипокини. 66 3.6.2 FACS (флуоресцентно активирано клетъчно сортиране) анализ на изолирани адипоцити. 67 3.6.3 Оцветяване на адипоцитите с маслено червено О. 67 4. Резултати. 69 4.1 Фенотипизиране на σ1b-дефицитен щам на мишка. 69 4.1.1 Воден баланс на мишките с дефицит на σ1b. 69 4.1.2 Серумен анализ на мишки с дефицит на σ1b. 78 4.1.3 σ1b-зависима функция на мастната тъкан. 79 4.1.3.1 Характеризиране на мастната тъкан. 80 4.1.3.2 Функционално изследване на мастната тъкан. 83 4.1.3.2.1 Глюкозен толеранс на мишки с дефицит на σ1b. 83 4.1.3.2.2 Концентрации на адипоцитокини в серума. 85 4.1.2.3.2 Влияние на диета с високо съдържание на мазнини върху теглото на мишки с дефицит на σ1b. 87 4.1.3.3 Диференциация на мастната тъкан. 90 4.1.4 Поведенчески проучвания върху мишки с дефицит на σ1b. 100
Съкращения V Съкращения Å Ångström Фиг. Фигура ad запълване до окончателен обем a.d. aqua destillata ADP аденозин дифосфат AP адаптер протеинов комплекс APS амониев персулфат ARF ADP-рибозилиращ фактор BFA Brefeldin A bp базова двойка BSA говежди серумен албумин C градуса по Целзий CCV покрита с клатрин cdna комплементарна ДНК Ci Curie (2.22x10 6 броя в минута) COP Дезоксиаденозин трифосфат dctp дезоксицитидин трифосфат DEPC диетилпирокарбонат dgtp дезоксигуанозин трифосфат dh т. е. DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium dntp дезоксирибонуклеотид DMSO диметил сулфоксид ДНК дезоксирибонуклеинова киселина DTT дитиотреитол dttp дезокситимидин трифосфат E. coli Escherichia coli EDTA етилен диамин тетраацетат
Съкращения VI EGF епителен растежен фактор ELISA Ензимно-свързан имуно-сорбентен анализ Вграден ENTH епсин N-крайна хомология ER Ендоплазматичен ретикулум ERGIC ER-Golgi междинно отделение ES ембрионални стволови клетки и др. et alii (лат.: и други) EtBr етидиев бромид FACS активирано от флуоресценция клетъчно сортиране FKS фетален телешки серум g грама GAE γ-адаптин-ухо-хомоложен GAP GTPase-активиращи протеини GAPDH глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа GGA и TOM1 фосфат гуаноин GDP-нуклеотиден обменен фактор GGA Локализиран на Golgi, съдържащ γ-ухо, ARF-свързващи протеини GLUT4 транспортер на глюкоза 4 GTP гуанозин трифосфат h час H 2 O вода, т.е. 2 O дестилирана вода HRP хрян пероксидаза IgG имуноглобулинG ip интраперитонеално k kilo kb kilobases ko нокаут L литър LB лизогенен бульон M моларен
Съкращения VII ma милиампер MEF миши ембрионални фибробласти mg милиграми min минута ml милилитри mm милиметри mm милимолари mmhg милиметри живак MOPS 3- (N-морфолино) -пропансулфонова киселина MPR маноза-6-фосфатен рецептор mrna messenger nm рибонуклеинова киселина µg нанометри nng nnm nn n-краен аминотерминален OD оптична плътност PAA полиакриламид PBS фосфатно буфериран физиологичен разтвор PCR полимеразна верижна реакция ph отрицателен десетичен логаритъм на протонната концентрация PI-3-P фосфатидилинозитол-3-фосфат PI-4-P фосфатидилинозитол-4-фосфат PI-4,5P 2 фосфат PI-4,5P 2 фосфат PI-4,5P 2, 5-бисфосфатна PM плазмена мембрана pm picomolar PP2A протеин фосфатаза 2A PVDF поливинилиден дифлуорид РНК рибонуклеинова киселина RNAse рибонуклеаза RT стайна температура обороти в минута s. вижте SDS натриев додецил сулфат
Съкращения VIII SNARE SSC сек Tab. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. UV V срв. VHS WT w/v v/v xg напр. "SNAP и NSF рецептори за привързване" стандартен физиологичен разтвор цитрат втора таблица Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N тетраметилдиамин транс-Golgi мрежа трихидроксиметиламинометан ензим единица (единица) през нощта ултравиолетова светлина волта сравняват Vps27p, Hrs и STAM див тип тегло Съотношение обем към обем х пъти по-голямо от ускорението поради гравитацията, например
Въведение 7 е колокализирано (Simpson et al., 1997; Peden et al., 2004). Досега не е открит AP-3 в пречистени CCV от мозъчна тъкан (Simpson et al., 1996; Dell'Angelica et al., 1997b; Blondeau et al., 2004). Функционални проучвания с мутирал AP-3 клатрин свързващ мотив също не показват взаимодействие. Изглежда обаче, че в клетката съществуват популации, свързани с клатрин, както и без клатрин (Peden et al., 2004). AP-3 свързани CCVs могат да бъдат изолирани от човешката епителна туморна клетъчна линия HeLa (Borner et al., 2007). Следователно може да се окаже, че свързването с клатрин-AP-3 е много крехко или че количеството на AP-3-свързващи, обвити с клатрин везикули варира в различните типове клетки (Newell-Litwa et al., 2007). Комплексът AP-4 няма класическа кутия за клатрин и не е установено специфично взаимодействие. AP-4 обаче е открит в близост до клатрин в изображения с електронен микроскоп (Barois и Bakke, 2005). Фигура 3: Специфични транспортни пътища, медиирани от адаптерни протеини TGN: Транс-Голджи мрежа; b ee: базолатерална ранна ендозома; aee: апикална ранна ендозома; Lys: Lysosom, re: рециклиране на Endosom за допълнителни обяснения виж текста (след Schu, 2005).
Въведение 9 има място на свързване, но µ1 субединицата, за разлика от µ2, няма мотив за свързване с фосфатидилинозитол фосфат. Фигура 4: Структура и състав на (а) AP-1 и (b) AP-2 Отделните подразделения се идентифицират със съответните цветове, както е показано на схеми (b) и (d). Съответното място на свързване на YxxΘ е подчертано от овал и мястото на свързване PI-4-P в AP-1 и мястото на свързване PI-4,5-P2, заето от D-мио-инозитол-хексакисфосфат (IP6) в AP2 от кръг. В сравнение с μ2 субединицата, в μ1 субединицата на AP-1 липсва мястото на свързване на фосфатидилинозитол. (Collins et al., 2002; Heldwein et al., 2004) Ядрото на адаптерните комплекси измерва приблизително 100 Å x 80 Å, като шарнирният домейн на двете големи субединици вероятно се простира до 200-300 Å, тъй като няма стабилна вторична структура. Следователно доменните уши могат да бъдат разположени далеч от мембранно свързаното ядро на комплекса и да взаимодействат с други протеини в цитоплазмата.
Въведение 10 Фигура 5: Схематично представяне на различните изоформи на субединиците на AP-1. Две изоформи са известни както за γ, така и за μ1. Има дори три изоформи, описани за σ. σ1b беше открит в три варианта на снаждане. За много от адаптините изоформи са описани при бозайници, които са кодирани от няколко гена. Варианти на снаждане са открити само за α-адаптин. В случая на AP-1 се експресира поне една алтернативна изоформа за всички участващи протеини, с изключение на субединицата β1. Схематично компилиране на тези протеини е показано на Фигура 5. Изоформата γ2 е 60% хомоложна на γ1 адаптин. Той е съкратен в променливия шарнирен регион. За разлика от γ1 субединицата, не може да бъде открито взаимодействие между γ2 и β субединицата в хибридната система с дрожди. Това предполага, че няма in vivo комплекс с γ2. Известни са три гена за σ1-адаптин, σ1a, -B и -C. Те показват 70-80% идентичност на ниво протеин (Riel, 2004). In vitro, σ1a и σ1b се свързват и с двете γ-изоформи (Takatsu et al., 1998; Takatsu et al., 2001). Освен това в нашата лаборатория бяха направени три различни варианта на снаждане
Въведение 15 Като цяло, няколко киселинни аминокиселинни остатъци предшестват тези, те също се наричат киселинни клъстерни мотиви на дилевцин. В този случай аспартатът (D) не може да бъде заменен. За разлика от сигналите (D, E) xxxL (L, I), DxxLL не се свързва с AP комплекси in vitro, а с мономерните адаптери от семейството GGA (Puertollano et al., 2001; Zhu et al., 2001 ) (вж. 1.1.3). Друго семейство мотиви за сортиране се състои от последователност от аминокиселини, които съдържат едно до три места за фосфорилиране на казеин киназа II (CKII). Този мотив се намира в много трансмембранни протеини, които циркулират между TGN и ендозомите. Фосфорилирането чрез CK-II е основно необходимо за обратния транспорт от ендозомите до TGN. За протеина PACS1 (фосфофуринов киселинен клъстер, сортиращ протеин 1) може да се покаже, че той свързва фосфорилирани киселинни групи, както и AP-1 и AP-3. Свързващата повърхност на AP-1 е идентифицирана на µ и σ (Wan et al., 1998; Crump et al., 2001).
Въведение 16 1.1.2.3 Взаимодействия на AP-1 с допълнителни протеини Фигура 6: Мрежата на AP-1 и неговите партньори за взаимодействие Свързващите линии между отделните протеини символизират взаимодействие. Описани са допълнителни партньори за взаимодействие, за които се смята, че генерират среда, специфична за AP-1 CCV. Повечето от тези допълнителни протеини се свързват с ушните домейни на големите субединици на AP-1, като γ1 взаимодействията имат най-голям афинитет. Тъй като тези домейни показват най-малко сходство между адаптините, се правят много специфични връзки. Фигура 6 показва AP-1 свързващи протеини и взаимодействията между компонентите са символизирани с линии. Не всички тези протеини могат да бъдат обсъдени подробно по-долу, така че ще се огранича до тези, за които има най-много информация. Функциите на повечето от тези протеини са неизвестни и значението на свързването с AP-1 е изследвано само за няколко. Последната група включва ARF1GAP, който е необходим за разтварянето на протеиновата обвивка. Можете също да използвате Rabaptin5
Въведение 19 Остатъци след идентифицираните мотиви, WVQF и WGDF, от тези асоциирани протеини са причинени (Mattera et al., 2004). 1.1.3 GGA адаптери Мономерните GGA протеини (локализирани на Golgi, съдържащи γ-ухо, ARF-свързващи протеини) допринасят за образуването на протеини, покрити с клатрин върху TGN. GGA протеините бяха идентифицирани в бази данни на базата на хомологията на един от техните домейни до γ-адаптин-ушен домейн и изследвани по отношение на тяхната роля в процесите на сортиране в TGN (Bonifacino, 2004). Те се намират и в ендозомите. Три гена са описани при бозайници, които кодират GGA1, GGA2 и GGA3. Семейството е консервирано в еукариоти, а маята също има два GGA протеина. GGA протеините имат модулна структура (виж Фигура 7). Трите му сгънати домейни са свързани с неструктурирани последователности. Фигура 7: Модел на структурата на GGA1 Структурите на отделните домейни бяха комбинирани тук, за да образуват модел и техните свързващи партньори бяха назначени на отделните домейни. Променено от (Ghosh и Kornfeld, 2004)