Синергетично използване на невронни клетки-предшественици и самосглобяващи се пептиди в експериментална шийка

Резюме

Въведение

Над 50% от нараняванията на гръбначния мозък са свързани с шийните прешлени. В клиничната практика са описани два основни физиопатологични механизма: първата контузия на гръбначния мозък и след това трайна компресия, причинена от костни фрактури, кръвоизливи или подуване на тъканите.

Контузионният миметичен/компресионен модел на аневризмен клип, два патофизиологични механизма: щракането на клипса води до контузия и продължителността на среза съответства на компонента на компресията, като се приема, че компресията в клинични условия, причинена от костни фрактури, кръвоизливи или подуване на тъканите последният етап приключи. Използваният клипс за аневризма е модифициран от пръстеновидна пружина, осигуряваща точна и възпроизводима сила на прищипване. Особено в сравнение с модела на хеми-трансекция или контузия, този модел на клип за аневризма имитира по-добри клинични параметри. Въпреки че пациентите с наранявания на гръдния кош страдат от параплегия, повечето пациенти с инфекция на шийката на пикочните пътища са квадриплегични и напълно зависими. Анатомичната структура на шийната връв обаче показва значителни разлики в сравнение с гръдната или лумбалната и следователно в този протокол се разглежда особено.

Развитието на медуларни кухини и тъканни белези са пречки за възстановяване и регенерация. Преодоляването на тези препятствия с използването на скеле оборудване е обещаващ подход. Самосглобяващите се пептиди могат да се инжектират директно в епицентъра на лезията. Там те се сглобяват в скелета от нанофибри, за да преминат в кухината и да подобрят околната среда, като намалят инхибиторното възпаление и плашат тъканите. Въпреки че твърдите материали причиняват значително увреждане на гръбначния мозък по време на имплантацията, пептидите могат да бъдат инжектирани безопасно и без допълнителни тежки увреждания.

Подобряването на инхибиторната среда със самосглобяващи се пептиди преди трансплантацията на стволови клетки, следователно, подпомага КЛЕТКОВА ИНТЕГРАЦИЯ, диференциация и в крайна сметка функционално възстановяване след нараняване на шийката на гръбначния мозък.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

ЗАБЕЛЕЖКА: Следният експериментален протокол е одобрен от Комитета за грижа за животните към Университетската здравна мрежа (Торонто, Канада) и отговаря на политиките, изложени в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни, изготвено от Канадския съвет за грижа за животните .

1. Модел на конвузия/компресия на щипка за аневризма на маточната шийка

2. Инжектиране на PAS и PNJ (14 дни след нараняване)

90% живи клетки в клетъчната суспензия. Разредете клетките в растежна среда (50 х 103 живи клетки/µl), след което ги използвайте за клетъчна трансплантация.

  • Направете четири 2 µl (8 µl общо, съдържащи 4 х 105 NPC) интрапинални инжекции двустранно на 2 mm рострално и каудално от мястото на лезията. След отваряне на твърдата мозъчна обвивка, поставете стъклената микрокапиляра Hamilton на 1,5 mm под гръбната повърхност на гръбначния мозък и инжектирайте 2 µl клетъчна суспензия. Изберете скорост на инжектиране от около 0,5 l/min (min).
  • В края на всяка инжекция и преди да извадите капиляра от кордата, изчакайте поне една минута за разтягане на тъканта, за да побере новия обем на клетката. (Фигура 2)

    • 3. Имплантиране на субдурални помпи за прилагане на фактор на растежа

    4. оценка на тъканите

    1. Принасяйте в жертва животни в края на периода на наблюдение (напр. 4 седмици след SCI) в дълбока анестезия (5% изофлуран за 2-3 минути) и перфузирайте транскардиите с 50 ml студ (4 ° C), последван от студен физиологичен разтвор 150 ml 4% параформалдехид в 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).
    2. Премахнете гръбначния мозък и го поставете в 4% параформалдехид в 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) за 24 часа.
    3. Поставете гръбначния мозък в 25% разтвор на захароза за криозащита за 48 часа.
    4. Осигурете надлъжни криосекции с дебелина на задължителния абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Когато изпълнявате описаната по-горе процедура, ще получите скеле SAP, запълващо кухината и осигуряващо подобрена инхибиторна среда, по-малко плашене на тъкани и увеличена преживяемост на AFN. Фигура 4 показва надлъжен разрез на гръбначен мозък на плъх, получен на мястото на лезията шест седмици след SCI и четири седмици след инжектиране на NQ6 SAP и трансплантация на PNJ. NQ6 пептидите бяха успешно инжектирани в връвта, агрегирани в епицентъра и дифузирани ростро-каудално в полусянката. Образният електронен микроскоп показва освен това включен фигура 5, поставете 1% (w/v) NQ6 пептиди на нанофибърно скеле в рамките на два часа, разредени в PBS разтвори.