Широкомолекулярно молекулярно генетично изследване на вариации на номера на ДНК копия (CNV) в
От Института по невропатология на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦИЯ Широкомолекулярно молекулярно генетично изследване на вариации на номера на ДНК копия (CNV) при холангиоцелуларни карциноми за придобиване на академична степен Doctor medicinae (д-р мед.) Представено на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin от Александър Арнолд Ramenskoye дата на докторат: 09.09.2016
Фигура 1-1 Класификация на подвидовете холангиокарцином на интрахепатални и екстрахепатални (перихиларни и дистални) въз основа на анатомичното местоположение съгласно класификацията на UICC. Изменено от Blechacz et al, 2011 (10) 1.3 Епидемиология на холангиокарцином Честотата на холангиоцелуларен карцином, който представлява 3% от всички стомашно-чревни тумори, се увеличава в световен мащаб (12, 13). Честотата обаче варира значително в различните страни, като в Западна Европа е 1-2/100 000 и до сто пъти по-висока в Югоизточна Азия (14). Различните местни рискови фактори и генетични условия са отговорни за това несъответствие (15). Както при интра-, така и при екстрахепаталните холангиокарциноми, мъжете са засегнати по-често от жените в световен мащаб, като съотношението е 1,5 (14). И при двата подтипа повечето от засегнатите са на възраст над 65 години, когато се постави диагнозата (16). Пациентите обаче са в страни с по-висока честота (Югоизточна Азия) 7
Фигура 1-2 Макроскопска класификация на интрахепаталните холангиокарциноми според Изследователската група за рак на черния дроб на Япония (LCSGJ). Blechazc et al, 2011 (10) В случай на екстрахепатални холангиокарциноми отново се прави разлика между екзофитен и интрадуктален модел на растеж (42), като двата типа са свързани с периневрална инвазия и засягане на лимфните възли (10). За хистологичната класификация на холангиокарциномите, в допълнение към класификацията на СЗО, съществува актуалното издание на AJCC/UICC, което описва аденокарциномите като най-често срещаната форма, както и по-редки форми (аденосквамозни и плоскоклетъчни карциноми, муцинозни, уплътнени пръстеновидни клетъчни, саркоматозни, лимфоепит, лимфоепит, лимфоепит 43, 44). Най-честата форма на холангиоцелуларен карцином е умерено до добре диференциран аденокарцином, който се характеризира с жлезиста или тръбна структура. Кубичните или колоновидни анапластично променени епителни клетки показват еозинофилна цитоплазма с кръгли централни ядра. Хетерогенните туморни клетки често се разпространяват по стените на жлъчните пътища и нервните обвивки (45). 11.
За фармакологичното лечение на холангиокарцином до 2010 г. не е имало стандартизирана химиотерапия поради недостатъчни данни. Монотерапията с гемцитабин, която се използва широко, дава само незадоволителни резултати (98). С проучванията NCRI ABC-01 и ABC-02 от Англия обаче е установена потенциално определяща тенденция терапия, състояща се от гемцитабин и цисплатин за нерезектабилни тумори на системата на жлъчните пътища (99, 100). Резултатите от тези проучвания могат да бъдат потвърдени и от сравними изследвания в Япония (101). Моноклоналните антитела, които конкретно се намесват в молекулярните процеси, също са нови терапевтични подходи (102). Текущите им отправни точки и по-новите резултати от изследванията ще бъдат разгледани допълнително в раздела за дискусии. 19-ти
3 Материал и методи 3.1 Пациенти и туморни проби За отделните изследвания са на разположение различни колективи от туморни проби, които са представени подробно. 1. За анализ с помощта на молекулярна инверсионна сонда (MIP), имунохистохимия и флуоресценция in-situ хибридизация (FISH) са използвани 24 фиксирани с формалин туморни проби, вградени в парафин (FFPE) от архивите на Института по патология, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Всички проби бяха определени за MIP и имунохистохимично изследване и 20 избрани проби за FISH анализ (Таблица 3-1). Таблица 3-1 FFPE туморна популация. 21-ви
2. За разследването с помощта на RT-PCR, 30 криоконсервирани туморни проби, които след хирургично отстраняване са замразени с шок в течен азот и се съхраняват при -80 С, от архивите на Клиниката по обща, висцерална и трансплантационна хирургия, Charité - Universitätsmedizin Berlin ( Таблица 3-2). Този колектив включва само интрахепатални холангиокарциноми. Таблица 3-2 Популация на криосервиран тумор. 22-ри
Благодарение на модерната мултиплекс технология, повече от 20 000 MIP могат да преминат през процеса в един подход и по този начин да бъдат анализирани. Фигура 3-2 Реакционна последователност на подхода MIP: (1) Свързване на MIP с геномната ДНК (2) Запълване на празнини чрез полимеризация (3) Лигиране на хомоложните краища на MIP (4) Екзонуклеаза премахва нереагиралите проби (5) Освобождаване на пробата (6 ) Усилване на MIP с помощта на PCR. Променено от Hardenbol et al, 2003 (105) 26
Фигура 3-3 Резюме на работния процес на MIP. Модифицирано съгласно Hardenbol et al, 2003 (105) Материал и разтвори: За да се извърши MIP изследването, 75 ng от предварително извлечената ДНК на геномния тумор бяха прехвърлени във воден разтвор. Изпълнение: Хибридизация на масива OncoScan TM FFPE Express 2.0. Методът за молекулярна инверсия е извършен от Affymetrix (Санта Клара, САЩ). 3.5 Анализ на данните за броя на копията с помощта на софтуер за копиране на Nexus. Всяка проба от масива MIP определя локализация по генома, която се определя от интензивността на флуоресценцията на MIP ще. Преобразуването на интензивността на сигнала в промени в броя на копията се нарича сегментиране. Алгоритъмът SNP-FASST2, който се използва от софтуера Nexus, свързва интензивността на масива в експеримента с вътрешен контрол и трансформира това, като използва логаритъма към база 2 (log2). Само нетуморни проби са групирани като контроли, които след това служат като референтен сигнал, с който всяка туморна проба се сравнява в стъпка по стъпка. Съответно, изтриването води до дадено местоположение на SNP 27
при по-ниска интензивност на сигнала в сравнение с еталонната, докато усилването води до увеличен сигнал (Фигура 3-4). Фигура 3-4 Схематично представяне на разпределението на интензитета на сигнала на MIP към място по протежение на хромозомата. Ръководство за номер на копие на Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) За всяка проба тези стойности на log2 са показани на оста x като местоположението на пробата и на оста y като стойността на съотношението на логаритъма (Фигура 3-5). Фигура 3-5 Пример за резултатите от експеримент и представянето му като графика по протежение на генома. Ръководство за номер на копие на Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA)
Фигура 3-6 Схематично представяне на честотата на B алела. Ръководство за номер на копие на Nexus (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Тази информация за състоянието на броя на копията и съотношението на алелите позволява на софтуера да извиква сигнали за интензивност. Следващата таблица 3-3 обяснява как трябва да се интерпретират сигналите. В случай на спечелване на единично или множество копия, човек очаква да види алелен дисбаланс в диаграмата на честотата на алелите. Ръстът рядко може да бъде толкова силен, че почти измества присъствието на другия алел, така че да се представи образът на LOH. Загубата на копие на алел ще се покаже като LOH, докато хомозиготна загуба ще се разкрие като пълна алелна загуба. Комбинацията от непроменен статус на номер на копие и LOH в диаграмата на честотата на алелите показва неутрален LOH на копиране. Този процес, известен също като еднородствена дисомия (UPD), се случва, когато и двата алела се предават от един родител. 30-ти
Таблица 3-3 Резултати, които трябва да се очакват при комбиниране на състоянието на номер на копие и честота B алел Ръководство за Nexus Copy Number (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Изпълнение: Суровите данни бяха анализирани с помощта на Nexus 6 Copy Number Software (Biodiscovery, El Segundo, CA) с NCBI build 36.1 на човешкия геном. За това е избран алгоритъмът за сегментиране SNP-FASST2. 3.6 Полимеразна верижна реакция (PCR) In vitro техниката на PCR позволява целенасочено дублиране на ДНК последователности, които са обрамчени от известни ДНК сегменти. Площта на ДНК, която трябва да се репликира, се ограничава от изкуствено произведени праймери, които служат като начална помощ. Праймерите са къси, едноверижни ДНК молекули, които допълват краищата на определена последователност на ДНК матрицата. След първоначална денатурация на двуверижната ДНК на две единични вериги и последващо отглеждане на праймера, ДНК полимеразата се разширява при предварително определени условия на реакция и в присъствието на 31
IDH-2 напред: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCGTCTG-3 IDH-2 обратно: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Електрофореза с агарозен гел Полученият PCR продукт се открива чрез разделяне на ДНК фрагменти с помощта на гел електрофореза. Прилагането на електрическо поле към гела кара ДНК сегментите да мигрират към анода поради техните отрицателно заредени фосфатни остатъци. След оцветяване на ДНК лентите с етидиев бромид, флуоресцентно багрило, което се интеркалира с ДНК, на отделните ДНК ленти може да се присвои определен размер, като се използва стандарт. Материал и разтвори: 2% агарозен гел (SERVA, Хайделберг, Германия) със 100 μL етидиев бромид на 100 ml гел разтвор 50 х TAE буфер (AppliChem, Дармщат, Германия). Процедура: PCR продуктите се зареждат върху 2% агарозен гел и след прилагане на напрежение 100V, за около 20 минути. разделени чрез гел електрофореза. 3.8 Пречистване на PCR за секвениране За да се избегне припокриване на сигнала по време на секвенирането, PCR продуктът трябва да бъде пречистен от праймери, излишни нуклеотиди, соли и Taq полимераза преди реакцията на секвениране. 33
Материал и разтвори: 3,85 μl aqua bidest 0,1 μl 1U/μl SAP 0,05 μl 1U/μl 200U/μl Exo I 0,5 μl Exo I буфер 0,5 μl SAP буфер 5 μl PCR продукт Процедура: За ензимно пречистване, реакционната смес с общ обем 10 μL се поставя в термичния циклер за 30 минути. до 37 ° С и след това за 15 минути. нагрята до 85 С. 3.9 ДНК секвениране Методът на секвениране съгласно Sanger et al. (106, 107), който е известен също като метод за прекратяване на веригата или дидеоксинуклеотид, е възможно да се анализират едноверижни cdna и gdna, които присъстват като единична верига в реакцията на секвениране поради денатурация. Чрез използване на маркирани с флуоресценция дидеоксинуклеотиди (всеки от четирите ddntps е свързан с различен флуоресцентен маркер), реакцията на секвениране може да се осъществи в реакционна смес, тъй като откриването на лентите за всяка от четирите ddntps води до различен цветен сигнал. Материал и разтвори: 2 μl 10 mm грунд TP362/TP363 2 μl ензимно пречистен PCR продукт 8 μl aqua bidest 34
Проверете усилванията и загубите в ДНК секции. Интерфазите FISH бяха проведени на секции TMA с помощта на комплекта принадлежности за хистология FISH (Dako, Хамбург, Германия), съгласно инструкциите на производителя. Сондите FISH, изброени в таблица 3-4, бяха използвани за откриване на усилвания и заличавания. Хибридизацията се извършва в автоматични машини за хибридизация (Dako, Хамбург, Германия) и е любезно предоставена от Dr. Dido Lenze, Институт по патология, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Таблица 3-4 Резюме на използваните сонди FISH Детекцията и количественото определяне на сигнала са извършени на Axio Imager Z1 (Zeiss, Йена, Германия) и софтуера Isis (версия 5.3.1, MetaSystems, Altlussheim, Германия). За да се оцени броят на копията на всяка отделна проба, бяха преброени специфичните за гена и центромерите сигнали в 20 неприпокриващи се ядра на туморни клетки. Сега генно-специфичните сигнали бяха сравнени със специфичните за центромери сигнали (брой генни копия: брой хромозомни копия). Амплификацията беше коефициент> 2.2 и коефициент 50%. 50
Фигура 4-6 Обобщение на мутационния анализ на IDH-1 и IDH-2 с представителни примери за мутации в гените IDH-1 и IDH-2. 54