Разработване на паралелен многокомпонентен анализ на антиген-антитела реакции в

Разработване на паралелен многокомпонентен анализ на реакции антиген-антитела при допинг анализ Дисертация за придобиване на академична степен „доктор рерум натуралиум“ (д-р рет. Нар.) В научната дисциплина по биохимия, подадена във Факултета по математика и естествени науки на Университета в Потсдам от Кай Вундерлих Потсдам, 29 септември 2014 г.

многокомпонентен

Това произведение е лицензирано съгласно лицензионно споразумение на Creative Commons: Признание Без търговска употреба Без производно произведение 4.0 International За да видите условията на лиценза, моля, следвайте хипервръзката: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Онлайн публикувано на сървъра за публикации на Университета в Потсдам: URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869

Животът е като мотор. Трябва да продължите напред, за да не загубите равновесие. Алберт Айнщайн

Съдържание Списък на таблици Списък на фигури V VII 1. Мотивация 1 1.1. Допинг в социален и спортен контекст. 1 1.2. Забраните за допинг и необходимостта от допинг контрол 5 1.3. Възможности и перспективи за тестове за точка на грижа в допинг контрола. 7 2. Основни положения 9 2.1. Терминът допинг и класификацията на класовете вещества в списъка на WADA забранени. 9 2.2. Аналитични методи за откриване на допинг вещества. 12 2.2.1. Газова хроматография/масспектрометрия като утвърден аналитичен метод за допинг анализ . 13 2.2.2. Методи за откриване въз основа на имуноанализ за откриване на пептидни хормони и растежни фактори 15 2.2.3. Как действат антителата и тяхната роля при имуноанализи. 16 2.3. Пептидни хормони като кандидати за разработване на многопараметричен допинг тест. 19 2.3.1. Лутеинизиращ хормон (LH) и ролята му на допинг агент. 20 2.3.2. Човешки хорион гонадотропин (hcg-i) и неговата роля на допинг агент. 23 2.3.3. Варианти на тези пептидни хормони и фармакологични гранични стойности. 24 2.4. Техническа концепция. 25 I.

4.3. Експерименти с микрочипове за определяне на кръстосаната реактивност . 60 4.3.1. Експерименти с микрочипове с едновременно използване на различни антитела за откриване върху референтен материал. 63 4.4. Определете границата на количествено определяне на пептидните хормони върху микрочипа. 67 4.4.1. Поредица от концентрации на hcg-интакт в 1 x PBS буфер 67 4.4.2. Поредица от концентрации на hcg-β в 1 x PBS буфер. 68 4.4.3. Концентрационни серии на LH в 1 x PBS буфер. 69 4.5. Измерване на реални проби върху стъклени и полимерни предметни стъкла 70 4.6. Извършете анализ на ефективността, за да определите D-SN и D-SP. 72 4.6.1. Определяне на диагностичната чувствителност и специфичност на LH, hcg-непокътнати и hcg-β. 72 4.7. Тест за устойчивост на съхранение на микрочиповете по отношение на резултатите от измерването. 77 4.7.1. Тест за стабилност при съхранение в продължение на дванадесет седмици за откриване на hcg непокътнат. 77 4.7.2. Тест за стабилност при съхранение в продължение на дванадесет седмици за откриване на hcg-β. 79 4.7.3. Тест за стабилност при съхранение в продължение на дванадесет седмици за откриване на LH. 80 5. Дискусия 83 6. Outlook 93 7. Резюме 95 Библиография 99 A. Приложение 111 A.1. Буфери и решения. 111 A.1.1. SDS гел състав за отделяне и събиране на гел 113 A.2. Маси. 114 A.3. Публикации. 126 A.3.1. Рецензирани публикации. 126

A.3.2. Лекции, както и постери и нерецензирани публикации. 127 A.4. Продължи. 128 A.5. Денят на благодарността. 129 А.6. Законова декларация. 130

Списък на таблици 3.1.1. Използвани устройства. 29 3.1.2.Използвани консумативи. 30 3.1.3 Използвани химикали и разтвори. 31 3.1.4. Антитела. 32 3.1.5 Пептидни хормони и материал за проба. 33 3.1.6.Използван софтуер. 34 3.2.1. Натоварване с гел SDS-PAGE. 36 3.2.2 Настройка на Western blot тест. 37 3.2.3 Експериментална схема, кръстосана реактивност върху микрочипове. 3.2.4 Класифициране на резултатите от измерването с помощта на матрица на истината 48 3.2.5 Размер на пробата за определяне на възпроизводимостта в продължение на дванадесет седмици. 51 4.1.1.Тест за кръстосана реактивност на антитела за моноклонално улавяне 56 4.1.2.Тест за кръстосана реактивност на антитела за поликлонално откриване. 57 4.2.1.Сравнение на промивните разтвори върху обработени микрочипове. 60 4.3.1.Тест за кръстосана реактивност с hcg-i върху микрочипове на откриването и вторични антитела в 1 x PBS. 61 4.3.2 Определяне на матрични ефекти и кръстосани реактивности в сложни проби. 65 4.5.1.Измерване на реални проби върху стъклени и полимерни предметни стъкла 71 4.6.1.ROC криви на анализа на ефективността на 130 серумни проби 73 4.6.2.Аналитична интерпретация на 130 проби от единично сляп подход. 75 4.6.3 Оценка на пробния колектив от Института по биохимия в Кьолн. 4.7.1 Тест за устойчивост на съхранение на микрочиповете за hcg-i в продължение на дванадесет седмици. 78 v

4.7.2 Тест за стабилност при съхранение на микрочиповете за hcg-β в продължение на дванадесет седмици. 4.7.3 Тест за стабилност на микрочиповете за LH в продължение на дванадесет седмици 81 А1. Ключ за проба от 130 серумни проби за анализ на ефективността. 114 А2. Тест за кръстосана реактивност върху микрочипове за откриване и вторични антитела при различни концентрации на hcg-i в 1 х PBS. 118 A3. Тест за кръстосана реактивност върху микрочипове на откриването и вторични антитела при различни концентрации на hcg-i в референтния материал. 119 A4. Тест за кръстосана реактивност върху микрочипове на откриването и вторични антитела в референтния материал. 120 A5. Определяне на матрични ефекти и кръстосани реактивности в сложни проби. 121 A6. Оценка на пробния колектив от Института по биохимия в Кьолн. 122 A7. Тест за стабилност на микрочиповете за hcg-i в продължение на дванадесет седмици 123 A8. Тест за стабилност на микрочиповете за hcg-β в продължение на дванадесет седмици. 124 A9. Тест за стабилност на микрочиповете за LH в продължение на дванадесет седмици 125

Списък на фигури 2.1. Списък на забранените вещества 2013 от WADA. 11 2.2. Анализ на допинг проби. 13 2.3. Диаграма на работния поток. 27 3.1. Точкови модел на микрочиповете. 40 4.1. SDS-PAGE за проверка на концентрацията на протеин. 54 4.2. Обобщение на теста за кръстосана реактивност на микрочипове върху GLYMO модифицирани стъклени стъкла. 66 4.3. Поредица от концентрации на човешки хорион гонадотропин hcg в 1 х PBS. 67 4.4. Поредица от концентрации на hcg-β в 1 x PBS буфер. 68 4.5. Концентрационни серии на LH в 1 x PBS буфер. 69 4.6. Серия за концентрация на LH в пълен серум. 70 VII

2.1. Терминът допинг и класификация на класовете вещества в списъка на забранените WADA Фиг. 2.1.: Списък на забранените вещества по WADA 2013 (съкратено). Класовете вещества (и примери), изброени тук, са забранени по всяко време в и извън състезанията. Пептидните хормони, изброени в точка S 2.2 (червена кутия): хорион гонадотропин (CG) и лутеинизиращ хормон (LH) са забранени само при мъжете, защото имат регулиращ ефект върху тестостероновата каскада. И двата хормона се определят от урината с помощта на имуноанализи. [WADA, 2012] 11

3. Материал и експериментална работа и биоактивност от 14 000 U/mg. Това съответства на биоактивност от 14 000 mu/µl в основния разтвор. Β-субединицата на hcg се предлага като основен разтвор с концентрация 0,1 mg/ml. Производителят не посочва никаква биоактивност за това. Според [Stenman et al., 2006], биоактивността за hcg-β е дадена като 1 U/µg. Съответно, основният разтвор на hcg-β съдържа 100 U/ml или 100 ul/µl. LH присъства в концентрация от 0,1 mg/ml. Раздел 3.2.3.: Тестова схема за откриване на възможна кръстосана реактивност на компонентите на анализа. Като пробна матрица, стандартният серум/кръв и контролен серум/кръв също бяха тествани по същата схема, аналогично на 1 х PBS буфера. Кръстоските означават комбинациите от пептидни хормони и антитела за откриване. поликлонални антитела за откриване срещу пептиден хормон hcg-α hcg-β LH CRP - - - - x - - - - - x - - - x - - - - x - - - x - - - 100 mu/ml LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 mu/ml hcg - x - - - - x - - - - x - - - x - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - x - - - - x 42