Протоколът за интервално обучение на TreadWheel за нежно предизвикано упражнение при Drosophila melanogaster

Обобщение

TreadWheel използва въртеливо движение, за да стимулира внимателно упражненията при възрастни Drosophila melanogaster, като се възползва от летящия вроден, отрицателен геотаксис. Той дава възможност за анализ на взаимодействията между упражненията и фактори като генотип, пол и диета и техните ефекти върху физиологичните и молекулярните тестове за оценка на метаболитното здраве.

Резюме

Въведение

Епидемиите от затлъстяване при деца и възрастни нарастват в култури, които консумират висококалорична диета и остават неактивни за дълги периоди от време, което може да доведе до сериозни дългосрочни ефекти, включително инсулинова резистентност, хронично възпаление и остеоартрит 1, 2, 3, 4. Преобладаването на тези нарушения продължава да нараства поради нарастващия дисбаланс в приема на калории и разходите, дължащ се на увеличената консумация на мазнини и захар и на преобладаващо заседналия начин на живот 5. Съответно, този енергиен дисбаланс доведе до увеличаване на честотата на захарен диабет тип 2 (T2DM) и сърдечно-съдови заболявания (CVD) 5. Хората са изложени на по-голям риск от развитие на двете заболявания, ако са диагностицирани с метаболитен синдром (MetS), коремно затлъстяване и симптоми на дислипидемия 2. MetS се формира от сложните взаимодействия между генотипа и различни фактори на околната среда, като диета и упражнения 6. Така че, за да получите пълно разбиране на основните механизми на това сложно заболяване, разгледайте всички тези фактори.

Що се отнася до борбата с MetS, лекарите първо препоръчват да се подложат на промени в начина на живот, които включват здравословна, балансирана диета и физическа активност 2, 7, 8. Тъй като ефективните лекарства са ограничени, а стомашната байпас хирургия е скъпа и изисква лекарски контрол през целия живот, фармакологичните и хирургичните интервенции се препоръчват само в тежки случаи и само във връзка с тези промени в начина на живот 3, 7, 8. По време на интервенции в начина на живот, като Б. Упражненията и диетата, които могат да създадат и поддържат дългосрочни цели за отслабване, независимо дали тези коригиращи действия могат напълно да облекчат негативните ефекти, свързани с MetS, се нуждаят от допълнително проучване 7, 8 .

Модели на мишки се използват за изследване на ефектите от упражненията върху метаболитните нарушения от години; въвеждането на изследвания за упражнения за полети на MetS обаче е сравнително ново начинание 9, 10, 11, 12. Мухите осигуряват идеалното средство за изучаване на упражнения в контролирана лабораторна среда, тъй като са лесни за манипулиране, имат кратка продължителност на живота, евтини за поддръжка и енергийни метаболитни пътища са силно запазени между дрозофила и хората 13. Г. Меланогастерните геноми са добре характеризирани и има изобилие от генетични инструменти за употреба при дрозофила, които дават представа за различните генотипове и взаимодействия между генотипа и околната среда, които биха могли да модулират ефекта от упражненията върху здравето на организма 14 .

За да стимулираме внимателно упражненията при дрозофила, разработихме тренировъчна машина, наречена TreadWheel (Фигура 1). Колелото на протектора (оттук нататък съкратено като TW) въртящо движение предизвиква вродената, отрицателна тенденция на геотаксис от гравитацията върху върха на флакона, което от своя страна стимулира изкачването в мухата за постоянно предефиниране. За разлика от други методи, усукващото движение на TW по своята същност е нежно, което минимизира броя на допълнителните стресови фактори, които могат да възникнат и да повлияят на резултатите. По този начин машинно-индуциращото упражнение при голям брой мухи без стрес позволява изследването на ефектите от упражненията върху метаболитното здраве (Фигура 2), Стареене, сън и много други теми 11 ще позволят.

Нашият метод следва обратен пирамидален протокол за интервални тренировки, който включва предимно аспекти на аеробно интервално обучение (AIT) с известна физическа подготовка за издръжливост. Стандартният режим на AIT се променя в този протокол, като увеличава продължителността на всеки интервал в продължение на пет дни, за да насърчи издръжливостта. AIT е особено полезен за предотвратяване на MetS в сравнение с други модалности на интервенция и е по-ефективен при обръщане на общите рискови фактори на метаболитния синдром, отколкото непрекъснатото умерено упражнение 19, 20. Недостатък на TW по отношение на Power Tower обаче е, че мухите свикват по-бързо с въртящото се движение, така че вариацията във вродената склонност да свиква с вземането на мухите може да затрудни интерпретацията на ползите от упражнението. Елегантно решение на това ограничение е описано от Watanabe и Riddle 15 и техния допълнителен член 21.

Протокол

1. Настройка и работа на колелото на протектора

Забележка: Вижте допълнителна фигура 1 за електрически схеми на TW Maschinenbau. Необходимите части са в Таблица на материалитеизброени. Фразите "TW", "TreadWheel", "устройство за обучение" и "машина" се използват взаимозаменяемо в целия протокол.

  1. Калибрирайте, мотор с превключвател за включване/изключване, така че да има пълно време на въртене от 15 s (4 оборота в минута). Скорост на машината пред флаконите за муха, прикрепени в закрепени скоби за калибриране на въртящите се рамена.
    1. Регулирайте скоростта със стандартен хронометър и неподвижен обект, временно прикрепен към машината, като малка четка с лента, прикрепена към капака на двигателя, като четката докосва въртяща се скоба. Определете времето за броя на оборотите в една минута с неподвижния обект като отправна точка и регулирайте скоростта, за да постигнете период на въртене от 15 s (4 оборота в минута).

2. Улавяне и поддръжка на мухи

Забележка: Всички мухи се грижат в инкубатор при 25 ° C с 50% влажност и 12-часов цикъл светлина/тъмнина между описаните манипулации на настолен компютър. Мухите се хранят със стандартна диета със сирище от меласа с царевично брашно, освен ако не е посочено друго.

  1. Пригответе всеки генотип с плочи за полагане на ябълков сок от агар, една капка дрождова паста на чиния и пластмасови бутилки от 6 унции събират яйца, които излюпват ларви.
    1. Пригответе плочи от агар с ябълков сок, напълнете 35 х 10 мм чаши Петри ¾ пълни, разтворени с 3% агар в закупен ябълков сок. Съхранявайте втвърдените чинии в хладилника до употреба.
    2. В 50 ml конична епруветка за центрофуга комбинирайте закупените сухи дрожди с дестилирана вода в съотношение 2 ml вода за всеки грам дрожди. Смесете маята с вода, за да създадете паста с консистенция на кетчуп със стъклена пръчка за бъркане. Регулирайте пропорциите на дрождите и водата, за да постигнете желаната консистенция.
    3. Съхранявайте дрожжевата паста в хладилника между употребите. Разхлабете капачката на тръбата, за да позволите дегазиране.
    4. Използвайте остра игла или нож, за да пробиете малки отвори в бутилките с квадратно дъно от 6 унции (полипропилен) като отвори за камерите за полагане.
    5. Намажете малко петно ​​от мая паста (

      След еднодневна почивка след попълване на протокола от упражненията, тествайте общ тест за ефективност на изкачване с бърз итеративен отрицателен тест за изкачване на геотаксис (RING) 22 .
        Поставете групи от 10 мухи в празни флакони с CO2 анестезия (или докоснете директно от флаконите с храна, ако вече са сортирани) и запечатайте с парафинов филм, за да предотвратите бягството на мухите. Дайте на мухите поне 10 минути, за да свикнат с новите флакони. За да не се преобърне бутилката, залепете с тиксо

      Забележка: Пробите, стандартите, стандартният разтвор на глицерол и работният разтвор на триглицерол, използвани по време на теста, трябва да се държат на лед по време на протокола и да се съхраняват в хладилник, когато не се използват.

      Представителни резултати

      Ние сме особено заинтересовани да идентифицираме факторите, които допринасят за цялостното метаболитно здраве на индивида. Преди това беше установено, че взаимодействието на генотипа чрез диета допринася значително за нивото на нарастване на популацията на метаболитните свойства 14. Това означава, че всеки генотип реагира на екологичните различия по уникален и сложен начин. За да разширим работата си върху ефектите върху генотип-околната среда, за да включим физически упражнения, ние разработихме колелото TreadWheel, което е способно да открива многобройни генотипове за аеробно интервално обучение (AIT) по начин с висока производителност.

      интервално

      илюстрация 1 : Тренажорът TreadWheel. (А.) машината побира 48 флакона и има функция за регулиране на скоростта. Тук експериментите бяха проведени при 4 rpm. (Б.) Отделни ампули с храна с експерименталните мухи бяха затегнати, завъртяща се шахта на място. (° С.) Разстоянието между запушалките на флакона и храната е 6 cm за флакони с упражнения и 1 cm за контролни флакони. След това флаконите бяха поставени на компютъра за упражнения. (Д.) 5-дневният режим на обратна пирамида е използван за обучение на летене. Всеки ден към един от пристъпите на упражнения се добавяха допълнителни пет минути, за да се увеличи постепенно интензивността на тренировката, моделите на издръжливост, интервалните тренировки. Тази цифра е взета от Mendez et al. модифициран 11. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

      treadwheel

      Фигура 2 : Оптични методи и представителни резултати. (А.) Методи за тестване на диетата на ларвите и взаимодействията при упражнения при възрастни. Ларвите се отглеждат на високомаслени или нормални лабораторни диети и преминават към локомотивен апарат при нормална диета. Възрастните мухи бяха разделени по пол, поставени в експериментални групи и упражнявани в продължение на пет последователни дни. След това беше извършен тест за изкачване на отрицателен геотаксис от пръстен и мухите бяха замразени за измервания на триглицериди. Представителни данни за триглицеридите се появяват две генетични линии, Oregon R и y 1 w 1 за (Б.) Жени и мъже (° С.). Всички мухи са отглеждани на нормален хранителен режим и са тренирани в зряла възраст. Нивата с различни букви се различават значително (стр. 11. Представителни данни за изкачване за линия DGRP 153 за (Д.) Жени и мъже (Д.) се показва. Всяка точка съответства на средното представяне при изкачване на 232 или повече души за три независими момента във времето. Лентите за грешки показват стандартна грешка. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

      обучение
      Допълнителна фигура 1: подробно схематично представяне на колелото на протектора. (А.) Схема на двойните флакони със скоба за флакон, прикрепени към машината. (Б.) Вътрешен изглед на въртящото се задвижване на машината. (° С.) Паралелна проекция на предната част на машината. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

      Дискусия

      Доказано е, че подробният тук протокол за упражнения стимулира нежно движение при дрозофила и може да се използва за симулиране на тренировки за издръжливост в контролирана лаборатория 11. Трябва да се отбележи, че при първоначалното разработване на концепцията на TreadWheel разгледахме търговски продукти, които биха могли да бъдат модифицирани, за да работят по подобен начин (например лабораторен ресторант). В крайна сметка отхвърлихме този подход, за да изберем дизайн, създаден по поръчка, тъй като търговските устройства не разполагаха с достатъчно ниска скорост (4 оборота в минута) и липсваха достатъчни възможности на флакона за генериране на проба с висока производителност.

      Проучванията с TreadWheel показаха, че средно физическото натоварване намалява телесното тегло, общото съхранение на триглицериди и гликоген, като същевременно увеличава съдържанието на протеини и катеренето 11. В допълнение, имаше променливи отговори относно пола и генотиповете за телесно тегло, както и триглицеридите, протеините, гликогена, глюкозата и нивата на упражнения 11, 15. Въпреки че променливостта в отговор на упражненията и диетата между генотиповете и пола може да бъде трудна за интерпретация, а понякога, противоположно, тя отразява източниците на истински биологични вариации, наблюдавани в естествените популации. Стремейки се да разберем разнообразието от фактори, лежащи в основата на високата степен на MetS, ще разработим инструменти, които ще улеснят разплитането на относителната важност на различни влияещи фактори, като тестват този фактор в моделни организми, за да разработят персонализирани интервенции за превенция и лечение. За да се оцени изцяло ефективността на упражнението, всеки от тези фактори и как те си взаимодействат трябва да се вземат предвид при провеждане на експерименти и извеждане на заключения.

      Разкриване

      Авторите не са разкрили нищо.

      Благодарности

      Бихме искали да благодарим на Джули Ярниган, Мередит Оуенс, Рейчъл Хил, Брандън Мой, Лора Мафла, Оливия Фиш и останалата част от лабораторията на Рийд за помощта при отглеждането на мухи и обработката на изображения. Шон Мендес построи оригиналния TreadWheel с помощта на сервиза на UAB. Това проучване е финансирано от NIH R01 GM 098856 LKR Бакалавърска академия за творчество и изследвания в Университета на Алабама KEL и BJW.