Производство на формулировки на частици за рекомбинантни протеини с помощта на кипящ слой - PDF
1 дисертация за придобиване на докторска степен във Факултета по химия и фармация на Университета „Лудвиг Максимилианс“ в Мюнхен Производство на формулировки на частици за рекомбинантни протеини с помощта на кипящ слой Matthias Ganz от Вюрцбург 2007
8 СЪДЪРЖАНИЕ 1. Въведение Производство на протеинови частици Флуидизиран слой Параметри на устройството Параметри на процеса Контрол на сушенето Протеиново сушене във флуидизиран слой Алтернативни процеси за производство на белтъчни частици Сушене чрез спрей Сушене чрез замразяване Сушене чрез замразяване Утаяване Свръхкритични течности Рентгенова фотоелектронна спектроскопия във фармацията Основи Качествен анализ на материала на прототипи и методи на анализ на спектратите вещества от човешки интерлевкин за кипящ слой обработва други вещества 24
9 СЪДЪРЖАНИЕ 3.2. Процесни системи GPCG-1 Система Mini-Glatt Аналитични методи Характеризиране на rhil SE-HPLC за анализ на агрегати RP-HPLC за анализ на сродни видове RP-HPLC за анализ на окислен метионин Гел електрофореза (SDS-страница) Лазерна дифракция Карл-Фишер поляриметрия DSC XPS UV спектроскопия BET повърхностно измерване Резултати и дискусия Сравнителни тестове в различни системи Тестове в системата GPCG-1 Тестове в системата Mini-Glatt Резюме Оптимизация на системата Mini-Glatt Понижена дюза Модифициран контейнер за материал и държач на дюзата 53
10 СЪДЪРЖАНИЕ Допълнително оптимизиран контейнер за материали Система Mini-Glatt с микро-комплект Обобщение на стабилността на формулировки rhil-11 Носители и разтвори за пръскане без стабилизиращи добавки Носители и разтвори за пръскане с добавка трехалоза MCC-Сфери и разтвори за пръскане с добавка PS80 Влияние на добавената захар в комбинация с 0,02% PS Обобщение XPS на продукти rhil-11 Спектри на носещите материали, трехалоза и rhil XPS анализ на носители с покритие rhil-11 Зареждане Изчисляване на покритието въз основа на XPS анализи Оценка на моделите Обобщена литература 125
11 Съкращения BE Енергия на свързване BET Brunnauer, Emmet и Teller BSA говежди серумен албумин DMSO диметил сулфоксид DSC диференциална сканираща калориметрия FD налягане на флуидизация FD налягане на флуидизация GPCG-1 Glatt Particle Coater Granulator-1 IR инфрачервена KAD конфигурация с понижена дюза LDH лактат дехидрогеназа MCC микрокристална микрокриларна киселина Национален институт по стандарти PS80 Полисорбат 80 rhgh Рекомбинантен човешки растежен хормон rhil-11 Рекомбинантен човешки интерлевкин-11 RP-HPLC Обърната фаза HPLC RS Свързани видове SD Спрей налягане SDS Натриев додецил сулфат SE-HPLC Различна хроматография SK Стандартна конфигурация WS Флуидизиран слой XPS рентгенова фотоелектронна спектроскопия
21 1 ВЪВЕДЕНИЕ 10 Постигнато 40nm (Thiering et al.; 2000a). По-нататъшно развитие на валежите е пръскането на протеиновия разтвор в съд със свръхкритична течност, поради повърхността, създадена по време на пулверизацията, протеиновите частици възникват в рамките на няколко секунди. С тази технология могат да се получат частици с еднаква форма и тесно разпределение на размера (Palakodaty et al.; 1999; Yeo et al.; 1993). В свръхкритичната флуидна технология свойства на протеиновите частици като разпределение на размера на частиците и морфология и др върху температурата и налягането на свръхкритичната течност (Jung et al.; 2001). Недостатъци са сложният процес и високата цена на процедурата.
33 2 ЦЕЛ 22 3) Впоследствие ще се изследва влиянието на различни носещи материали и различни добавки за разпръскващи разтвори като захар, повърхностноактивни вещества или антиоксиданти върху физическата и химическата стабилност на rhil-11 както по време на процеса, така и по време на съхранението. При неразтворимите MCC сфери влиянието на добавките за разпръскващ разтвор ще бъде изследвано независимо от ефекта на разтворимост на носещия материал. 4) По-доброто разбиране на повърхностното покритие на носителя с протеин или протеинова матрица би могло да предостави важни обяснения за белтъчната нестабилност, тъй като протеините могат да бъдат денатурирани на повърхности. С помощта на XPS трябва да се изследва разпределението на rhil-11 върху повърхностните/приповерхностните слоеве на частичните протеинови формулировки.
34 3 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 23 3 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 3.1 МАТЕРИАЛИ НА РЕКОМБИНАНТЕН ХУМАНЕН ИНТЕРЛЕВКИН-11 За всички експерименти се използва замразен воден насипен разтвор с приблизително 15 mg/ml rhil-11, 6mM натриев монофосфат, 4mM натриев дифосфат и 300mM глицин (pH 7,0 Wyeth BioPharma, Andover, САЩ). За някои експерименти глицинът от насипния състав се отстранява чрез диализа срещу фосфатен буферен разтвор (10 тМ, ph = 7). Използвана е диализна епруветка от типа Spectra/Por 7 с MWCO 3000 от Spectrum Medical Industries Inc., САЩ. ПОМОЩНИ ВЕЩЕСТВА ЗА ЕКСПЕРИМЕНТИ В ТЕЧНИ КРЕДИ Раздел: Спомагателни материали за тестове с кипящ слой Субстанция Описание Източник на доставката MCC-Spheres (Cellets 100) 98,2% = µm Pharmatrans Sanaq AG MCC-Сфери (Cellets 200) 98% = µm Pharmatrans Sanaq AG Захароза RFF захар Südzucker Трехалоза дихидрат Georg Breuer GmbH D-манитол (Pearlitol 200SD) 98,% EP Roquette D-манитол (Pearlitol 300DC) 98,% EP Roquette Glycine 99.0-101% Rexim (Degussa) Динатриев водород фосфат хептахидрат Merck, Дармщат натриев дихидроген фосфат монохидрат Merck, Дармщат метионин Fluka, Buchs, Швейцария
35 3 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ ДРУГИ ВЕЩЕСТВА Раздел: Допълнителни вещества Субстанция Описание Източник на доставка Acetonitrile HPLC quality, Fisher Scientific,> 99.9% Leicestershire, UK Амониев нитрат> 99% Grüssing, Filsum Colloidal Blue Staining Kit Stainer A and B Invitrogen, Karlsruhe Lithium chloride Riedel de Häen, Seelze Mark12 TM Molecular Standard for Invitrogen, Karlsruhe Gel electrophoresis metanol HPLC quality,> 99,8% Merck, Darmstadt Methionine Fluka, Buchs, Switzerland Морфолиноетансулфонова киселина (MES)> 99,5% Sigma, Steinheim натриев хлорид ACS,> 99% Sigma, Steinheim Натриев додецил сулфат, качество на електрофорезата,> 99% Roth, Karlsruhe Натриев хидроксид пелети годишно > 99% Merck, Дармщат Съдържа MOPS, NuPAGE MOPS с Tris Base, SLS, буфер EDTA Invitrogen, Karlsruhe Съдържа глицерол, Tris Base, tris NuPAGE LDS Проба HCl, LDS; EDTA, Invitrogen, Karlsruhe Buffer Serva Blue 250, фенол червено, вода NuPAGE редуктор 0.5M DTT Invitrogen, Karlsruhe PS80 Crillet HP, висока чистота Croda, Nettetal Trifluoroacetic Acid Sigma, Steinheim
36 3 РАСТЕНИЯ ЗА ОБРАБОТКА НА МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ ЗАВОД GPCG-1 За да могат визуално да следят процеса по-добре, тестовете бяха проведени стандартно в устройството за пръскане отгоре, беше използвана дюза с две вещества с вътрешен диаметър 1 mm. Филтърните торбички от плат се отърсват по двукамерен метод. Стандартните параметри са изброени в таб. Раздел: Стандартни параметри GPCG-1 Експерименти: Параметри на процеса, разтвор за пръскане, материал на носителя Параметри за контрол на процеса Стойност (единица) Скорост на флуидизиращ въздух 1,5 m/s Дюза за пръскане под налягане 1,9 бара Скорост на подаване спрей течност 2,8 g/min Входна температура 30 C Интервал на разклащане (филтър) на всеки 10 секунди (асинхронен ) Формулировка на спрей течност rhil-11 2.5 mg/ml фосфатен буфер 10mM, ph = 7.0 глицин 300mM количество пръскаща течност 250g количество носител 300g
37 3 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ СИСТЕМА MINI-GLATT В началото на разработката се извършват процеси в конфигурация на дънни спрейове без използване на колбаси. За пръскане се използва двуфлуидна дюза с вътрешен диаметър 0,5 mm. Флуидизирането на носещия материал и пулверизирането на разпръскващия разтвор се извършва със сгъстен въздух от къщата линия (6 бара). Сгъстеният въздух се регулира с помощта на редуктор на налягането в системата. Температурата на флуидизиращия въздух може да се регулира чрез нагряване в системата. Стандартните параметри са изброени в таб. Раздел: Стандартни стойности Експерименти с Mini-Glatt: Параметри на процеса, разтвор за пръскане, носител -11 4 mg/ml фосфатен буфер 10mM, ph = 7.0 глицин 300mM количество спрей течност 15g количество носител материал 20g