Производство на чиста култура - микробиологичен стаж
-
Експеримент D1: Получаване на чисти култури с помощта на намазки за разреждане
В този експеримент трябва да се приложат и изпробват различни техники на цитонамазка за разреждане (13-редов и 3-контурен метод) с цел получаване на чисти микробни култури.
Метод на цитонамазка с 3 контура:
И тук, инокулационната верига се отгрява и охлажда на ръба на плочата, за да се инокулира, преди да се вземе инокулум от пробата, която ще се разрежда. Инокулационната верига с инокулума се поставя леко върху агара и след това се разстила от ръба до ръба, но без да го докосва, в „зигзагообразно движение“ до около една трета до половината от плочата. Инокулационната верига отново се отгрява, охлажда се, чинията на Петри се завърта с приблизително 90 ° и след това се прилага намазка, така че материалът се поставя зад първата намазка, материалът се улавя от нея, като се плъзга върху нея и този материал продължава през плочата разпространява се друго „зигзагообразно движение“. Инокулационната верига се отгрява отново, охлажда се, чинията на Петри се завърта с приблизително 90 ° и се прилага трета намазка, аналогична на процедурата за втората намазка. Следващата скица има за цел да илюстрира отново техниката на линията с 3 отвора:
1 седмица
В този експеримент смесена култура на Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Rhodotorula glutinis с два различни метода на намазване, метод с 13 линии и метод с три цикъла, върху три различни хранителни среди (HPG, KB и YGC агар) се извършват фракционирани намазки. За тази цел вече налитите и готови за употреба плочи от агар бяха първо етикетирани от долната страна на чашите на Петри.
Хранителната среда имаше следния състав:
HPG агар
за 1000 ml аква демин. бяха добавени:
- 5,0 g екстракт от мая
- 5,0 g пептон от месо
- 0,25 g глюкоза
- 15 г агар
YGC агар
за 1000 ml аква демин. бяха добавени:
- 5,0 g екстракт от мая
- 20,0 g D (+) глюкоза
- 0,1 g хлорамфеникол
- 14,9 g агар
Агар King B (KB)
за 1000 ml аква демин. бяха добавени:
- 20,0 g протеазен пептон
- 10,0 g глицерин (чист)
- 1,5 g магнезиев сулфат (MgSO4)
- 1,8 g три-калиев фосфат 3-хидрат (K3PO4 × H2)
- 15,0 g агар
От всяка от изброените плочи с агар една се инокулира с помощта на 13-редов метод и една с помощта на триредов метод, така че се получават 6 агарови плаки. За тази цел клетъчната суспензия е снабдена със смесена култура от Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Rhodotorula glutinis Разбъркайте добре със смесителя за епруветки, след това охладете отгрятата инокулационна верига на ръба на агарната плоча KB и вземете инокулум от суспензията и го нанесете върху агаровата плоча, използвайки метода от 13 реда. HPG агарът и YGC агарът също се инокулират с инокулум от смесената култура, използвайки 13-редови метод. След това смесената култура се намазва, използвайки метода на цитонамазка с 3 контура, като агарът KB, YGC и HPG се инокулират един след друг с инокулационната верига. Инокулираните плочи от агар сега се инкубират с главата надолу: HPG плаките за 2 дни при 25 ° С, YGC плаките при 25 ° С за около 5 дни и KB плаките при 25 ° С за 3 дни.
3 седмици
През третата седмица беше извършен контрол на цитонамазката от цитонамазки, като отново се обърна внимание на хомогенността, изолирането и морфологичните характеристики на колониите, както и замърсяването.
В следващата стъпка чиста култура на Pseudomonas fluorescens по една наклонена култура от агар и по една криокултура, приготвена всяка.
Предоставената наклонена епруветка беше пълна с HPG агар (състав виж по-горе) и криомедиумът имаше следния състав:
Криомедиум
- 0,5 ml хранителен разтвор
- 0,5 ml 85% глицерин
- 3 стъклени мъниста (от занаятите)
Хранителна среда
за 1000 ml аква демин. бяха добавени:
- 5,0 g пептон за месо
- 3,0 г екстракт от месо
5-та седмица
През петата седмица всички плаки бяха изследвани макроскопски и проверени за чистота, хомогенност и замърсяване. Освен това всички агарови плаки бяха изследвани за флуоресценция под UV лампата (366 nm). Част от клетъчен материал беше суспендиран от намазката на криокултурата върху HPG агара и инокулум от него беше нанесен върху почистено стъкло на микроскоп и тази намазка след изсушаване беше микроскопирана при 400-кратно увеличение в ярко поле (виж 4-та седмица). Агарната плоча KB от намазката на наклонената агарова култура и HPG агарната плоча от криокултурата бяха отделени и използвани за теста за каталаза в експеримент D2.
Две седмици
Растежът на отделните микроорганизми се развива по различен начин: агарът на YGC е предимно с Rhodotorula glutinis, агар KB предимно с Pseudomonas fluorescens и HPG агар предимно с Bacilus subtilis обрасли.
Контролът на цитонамазката на HPG, YGC и KB агарните плочи в метода на цикъла с 3 цикъла и 13 редове даде резултатите, показани в следващите таблици:
| +: замърсяване -: няма замърсяване Фамилия: Име на замърсителя | |||
| 13-редов метод: | + | P. fluorescens | + |
| 3 цикъла намазка: | - | + | - |
Резултатите от характеризирането на морфологията на колонията са представени в следната таблица:
| YGC: Rhodotorula glutinis | червен | 1-2 мм | кръгъл | гладка | изпъкнал | гладка, лъскава | маслен | - |
| KB: Pseudomonas fluorescens | Бял | 1-4 мм | кръгъл | гладка | апартамент | груб | гелообразен | - |
| HPG: Bacilus subtilis | Бял | 1-2 мм | кръгъл | гладка | изпъкнал | гладка, лъскава | лигав | - |
3 седмици
Контролът на цитонамазката на втората цитонамазка от разреждане върху HPG агар даде следния резултат:
Rhodotorula glutinis: замърсен (замърсител Ризобий Спори), добра изолация на колониите
Pseudomonas fluorescens: замърсен (замърсител Ризобий Спори), няма изолиране на колониите
Bacillus subtilis: липса на замърсяване, добра изолация на колониите
4-та седмица
Проверка на чистотата на културата на наклонена агар на Pseudomonas fluorescens даде следния резултат:
Флуоресценция: добре
Макроскопска хомогенност: добре
Микроскопска хомогенност: добре
5-та седмица
Контролът на цитонамазката на криокултурата и наклона на агар на Pseudomonas fluorescens върху KB и HPG агар даде следния резултат:
KB наклонен агар: флуоресцентен, макроскопски хомогенен, без замърсяване
HPG агарен наклон: флуоресцентен, макроскопски хомогенен, без замърсяване
KB крио: флуоресцентен, макроскопски хомогенен, замърсен с РизобийHPG крио: флуоресцентен, макроскопски и микроскопски хомогенен, без замърсяване
Също така беше установено, че жълтото оцветяване на колониите е по-силно изразено върху KB агара, отколкото при HPG агара. Растежът върху криокултурните плочи също е по-силен, отколкото при агаровите наклонени култури.
Бил:
За глицерин (C3H8O3) е дадена маса от 10 g.
Моларната маса на C3H8O3 е резултат от:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 g/mol
Масата от 10 g на 1 l води до моларна концентрация от:
10 g/92 g/mol = 0,1086 mol/литър
За трикалиев фосфат-3-хидрат (K3PO4 x 3 H2O) е дадена маса от 1,8 g на 1000 ml.
Моларната маса на K3PO4 x 3 H2O е резултат от:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 g/mol
Следователно масата от 1,8 g на l съответства на моларна концентрация от:
1,8 g/266 g/mol = 0,0677 mol/литър
За магнезиев сулфат MgSO4 се дава маса от 1,5 g на 1000 ml.
Моларната маса на MgSO4 е резултат от:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120,3u 120,3 g/mol
Следователно масата от 1,5 g на l съответства на моларна концентрация от:
1,5 g/120,3 g/mol = 0,0125 mol/литър
В този експеримент каталазната активност на различни бактериални култури (Pseudomonas fluorescens и млечнокисели бактерии).
Кислородът в молекулярната си форма като молекула О2 има токсичен ефект върху всички живи клетъчни системи поради окислителния си ефект и е известен още като клетъчна отрова. Това важи още повече за анаеробните организми, тъй като те не използват кислород като краен електронен акцептор на дихателната верига и по този начин не могат да го направят безвреден под формата на вода (H2O). Активирането на кислорода може да приеме 3 различни форми, всички от които се катализират от така наречените оксидази и в които се образуват следните междинни съединения:
O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- оксидни йони
O2 + 2 e - -> O2 2- пероксиден йон
O2 + 1 e - -> O2 - супероксиден йон
Същото се отнася за тези кислородни йони, както е установено за молекулярния кислород: Те са много реактивни реактиви, които могат да увредят клетката и нейните компоненти в дългосрочен план. Ето защо повечето организми имат ензимни системи, които правят междинните продукти, които са резултат от намаляването на кислорода, безвредни. Оксидните йони реагират с протони, образувайки вода, която е безвредна за клетката, пероксидните йони реагират с Н + протони, образувайки водороден прекис (H2O2), който също е много реактивен и вреден за клетката. Супероксидният йон реагира с водороден пероксид и водородни протони, образувайки молекулен кислород, вода и хидроксилния радикал, който от своя страна е токсичен за клетката. Последващите реакции на кислородно активиране са изброени отново по-долу:
За да направят водородния пероксид безвреден, повечето аеробни организми имат ензима каталаза, който разгражда H2O2 до вода и молекулярен кислород:
Има и пероксидази, които могат да детоксикират водородния прекис чрез протониране:
За да се избегне образуването на хидроксилни радикали, аеробните и аеротолерантните организми имат ензима супероксиддисмутаза, който превръща супероксидния йон от активирането на кислорода в малко по-малко вредния водороден пероксид и молекулярен кислород:
Анаеробните организми обикновено имат нямат тези ензимни системи.
Каталазната реакция се използва за характеризиране на микроорганизмите, като може да наблюдава отделянето на газ от молекулярния кислород в организмите, които притежават този ензим. Тази реакция може да се използва за разграничаване между аеробни и анеробни и най-вече от аеротолерантни организми. [2]
В този експеримент бяха използвани отделените агарови плочки от намазките Pseudomonas fluorescens от експеримент D1 (KB агар от наклонената агарна култура и HPG агарова плака от криокултурата), както и плочите от агар от намазките на млечнокисели бактерии от експеримент H (агар M17 с Стрептококи и агар Рогоза с Лактобацилус) подложени на тест за каталаза. За тази цел първата от плочите с агар се поставя право върху лабораторната маса, капакът на чашата на Петри се отстранява и 3% разтворът на водороден прекис (H2O2), наличен от малка колба на Ерленмайер, се излива върху нея, така че агарът да бъде равномерно покрит от течността. След това беше направено кратко изчакване, за да се види дали има някакво отделяне на газ в течността над агара и резултатът беше отбелязан. Всички агарови плаки бяха тествани при същата процедура. Изпитаните агарови плочи се изхвърлят в отпадъците от автоклава.
Както тестът за каталаза с KB агар от агаровата култура на наклон, така и HPG агар от криокултурата са положителни, т.е. Силно отделяне на газ може да се определи визуално, което се характеризира с енергично образуване на пяна и образуване на мехурчета в течността. И двете плочи от агар (M17 агар с Стрептококи и агар Рогоза с Лактобацилус) от експеримент H не е открито никакво отделяне на газ.
В резултат на този експеримент може да се твърди, че Pseudomonas fluorescens Каталаза-положителна и следователно има защитния ензим каталаза, докато млечнокиселите бактерии Стрептококи и Лактобацилус Са каталазни отрицателни и нямат ензима каталаза. Така може Pseudomonas fluorescens класифицират като аеробни организми и млечнокиселите бактерии като най-малко аеротолерантни или дори анаеробни организми.
Трябва също така да се отбележи, че полученият газ също може да бъде събран и подложен на допълнителни изследвания, за да се провери дали всъщност е кислород (O2).