PDF ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ГЛУКОЗЕН МЕТАБОЛИЗЪМ - Безплатно изтегляне в PDF
Кратко описание
1 55 ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ГЛУКОЗЕН МЕТАБОЛИЗЪМ А. БИОХИМИЧНИ ОСНОВИ При здрави хора нивото на глюкозата в кръвта е.
Описание
ИЗПИТВАНИЯ ЗА ГЛУКОЗЕН МЕТАБОЛИЗЪМ A.
Хроничните чернодробни заболявания се появяват или са причинени от преобладаването на контра-инсулиновите хормони (напр. При акромегалия, болест на Кушинг, феохромоцитом). Първичните форми на диабета са разделени на две основни групи, а именно диабет тип I, т. Нар. Младежки диабет, чиято причина сега се приема за имунологични фактори, които водят до унищожаване на В-клетките и по този начин до дефицит на инсулин, от друга страна II Диабет (диабет при възрастни), за който други, отчасти все още неизвестни механизми са определящи. По правило това не води до липса на инсулин, а по-скоро до намален инсулинов ефект, напр. поради липса на инсулинови рецептори. По-специално с диабет тип II, който може да прогресира бавно в продължение на дълъг период от време и по този начин да остане неоткрит, прогресията на заболяването може да бъде предотвратена, ако се лекуват рисковите фактори затлъстяване, нарушения на липидния метаболизъм, физическо бездействие и преобладаване на анти-инсулиновите хормони. Тестът за толерантност към глюкозата, проведен в стажа, играе важна роля при откриването.
При диабет тип I имунологичните скринингови тестове (за антитела срещу части от островните клетки) ще играят по-голяма роля в бъдеще, тъй като се появяват много преди началото на заболяването, което обикновено е внезапно за пациента. В този момент обаче 80% от островните клетки обикновено вече са унищожени. Е
Поддържане на нивата на кръвната захар постоянни чрез строг метаболитен контрол (инсулин, диета, упражнения), за да се забавят вторичните заболявания като артериосклероза, слепота, увреждане на бъбреците, гангрена и невропатии. Определянето на гликозилирания хемоглобин, извършено в стажа, е важна помощ за това. Пациентите, страдащи от неконтролиран диабет, често имат високи концентрации на глюкоза в кръвта в плазмата. Това води до повишени концентрации на гликиран хемоглобин в еритроцитите. Еритроцитите от здрави индивиди с нормални нива на глюкоза в кръвта съдържат 4-7% от общия им хемоглобин в гликозилирана форма. При лошо или лошо контролирани диабетици тази стойност може да достигне 18-20%. Определянето на гликозилирания хемоглобин позволява дългосрочно наблюдение на нивото на кръвната глюкоза. Веднъж модифициран, хемоглобинът остава в кръвния поток, докато еритроцитът е жив (приблизително 120 дни). Повишеното ниво на гликиран хемоглобин започва да пада едва 5-6 седмици след регулирането на нивото на глюкозата и достига нормалните граници след около 20 седмици.
Показва концентрацията на глюкоза в кръвта, концентрацията на гликиран хемоглобин представлява вид интеграл от нивото на кръвната глюкоза в продължение на няколко седмици.
Тест за глюкозен толеранс При теста за глюкозен толеранс нивото на кръвната глюкоза се измерва в продължение на 1,5 часа след перорално излагане на глюкоза и ходът му във времето се сравнява с този на стандартен колектив. В допълнение към този индиректен тест за функционалността на В-клетките на островчетата Лангерханс, времевият ход на концентрацията на инсулин в серума може също да бъде определен директно с помощта на сложни имунологични техники. Увеличението и намаляването на концентрацията на глюкоза в кръвта, наблюдавано при теста за глюкозен толеранс при здрави хора (нормален колектив) или при диабетици е показано в таблица I. Подозира се асимптоматичен захарен диабет, ако се надвиши максималната стойност от 11,1 mmol/l, очаквана след 30-60 минути. 2-часовата стойност е диагностично по-ценна; ако е над 7,8 mmol/l, това е захарен диабет. За разлика от това, максимални стойности под 8,9 mmol/l и двучасови стойности по-долу
6.7 mmol/l нормалната граница. Стойностите в междинния диапазон са подозрителни и изискват проверка. До ф. За да не се застрашават пациенти с диабет с провокационен тест, манифестният диабет се изключва предварително с помощта на "дневен профил на кръвната захар".
Оценка на пероралната експозиция на глюкоза в кръвта след приложение на глюкоза Концентрация на глюкоза в кръвта в капилярна кръв в mmol/l 0 '
Тестът за глюкозен толеранс може също да се използва за откриване (и задействане) на патологична хипогликемия с различни причини (функционален хиперинсулинизъм; аденом на островни клетки), при които максималните стойности след перорално приложение на глюкоза остават под нормалните. Първичният захарен диабет може да бъде разделен на четири етапа: 1.
Потенциален диабет: няма диабетен метаболизъм, скрининговите тестове за диабет са нормални, но фамилна обремененост; приблизително 25% от нашето население
Латентен диабет: при стрес, бременност или наднормено тегло тестът за глюкозен толеранс също може да бъде положителен.
Асимптоматичен ("субклиничен" или "химичен") диабет: тест за глюкозен толеранс положителен; около 8% от населението.
Клиничен диабет: явен диабет; около 3% от населението. Хипергликемия и евентуално глюкозурия. Не се изискват скринингови тестове за диабет. В този случай тестовете могат да застрашат пациента!
Гликиран хемоглобин Гликираният хемоглобин се произвежда чрез неензиматично добавяне на глюкоза към аминогрупите на лизин в пептидната верига или към N-крайния край на субединиците и . Транспортер на глюкоза в мембраната на еритроцитите осигурява бърз обмен на глюкоза, така че в еритроцитите да има същата концентрация на глюкоза, както в плазмата. Алдозите реагират със свободни амино групи, за да образуват Schiff база. Чрез пренареждане на Amadori, гликозиловият остатък е необратимо ковалентно фиксиран във втория етап (фиг. 1).
Конкретното определяне на гликиран хемоглобин (HbA1) в хемолизата е възможно след предварително отделяне на хемоглобиновите фракции посредством йонообменна хроматография. Този процес на разделяне се основава на електростатичното взаимодействие на йони в пробата, която се изследва с йонообменник, който съдържа групи с противоположен заряд, които са ковалентно фиксирани към неразтворим носител (матрица). Противоионите, взаимодействащи с йонообменника, могат да бъдат заменени за други йони със същия заряд. В зависимост от заряда на йонообменника, йонообменници),
Йонообменници) с отрицателен заряд. Подобно на почти всички протеини, хемоглобинът носи електрически заряд във воден разтвор, който се причинява от киселинни или основни групи на страничните вериги на аминокиселините, както и от крайните amino и -карбоксилни групи. Нетният заряд на молекулата се получава от сумата на положителните и отрицателните индивидуални заряди и зависи от стойността на рН на протеиновия разтвор. РН, при което броят на положителните заряди на тези на
отрицателна и при която молекулата изглежда незаредена навън, се нарича изоелектрична точка. Под изоелектричната точка (IP) зарядът на молекулата е положителен (катион) и следователно може да бъде свързан към катионообменник, докато над IP има нетен отрицателен заряд (анион), който позволява на протеина да се свърже с анионния обменник. Електростатичният ефект между протеина и йонообменника може да бъде отслабен или дори напълно разтворен чрез промяна на стойността на рН или чрез увеличаване на концентрацията на сол (конкурентни йони). В този експеримент се използва слабо кисел катионен обменник за отделяне на различните подфракции на хемоглобина. Аликвотна част от хемоглобина се смесва с йонообменна суспензия. При избраните условия (рН = 7,0) се свързва само нормалният хемоглобин, докато гликозилираният хемоглобин (HbA1) остава в супернатантата. Различното адсорбционно поведение на двамата
гликозилиран и нормален хемоглобин, който се създава чрез необратимо свързване на глюкоза с амино група на протеина, докато стойността на рН остава непроменена, чийто общ заряд се измества към отрицателния диапазон и по този начин се намаляват силите на свързване между гликозилирания хемоглобин и йонообменника.
Общи въпроси метаболизъм на глюкозата; Регулиране на нивата на кръвната захар; Ефект на инсулина и инсулиновите антагонисти; Химия на споменатите хормони; Метаболитни промени при захарен диабет; Хемоглобин (структура, функция, крива на свързване на кислорода, ефект на Бор, буферен ефект, патологични промени: количествени и качествени хемоглобинопатии, сърповидно-клетъчен хемоглобин); Миоглобин.
ЦЕЛ НА ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ
Тест за толерантност към глюкоза След като изпитваното лице е приело перорално определено количество глюкоза, концентрацията на глюкоза в кръвта се повишава бързо - след като глюкозата се резорбира от чревния лумен. Концентрацията на глюкоза в кръвта се нормализира отново в рамките на определено време след началото на упражнението. Този процес трябва да бъде последван от определяне на концентрацията на глюкоза в капилярната кръв. Наблюдаваното повишаване и намаляване на концентрацията на глюкоза в кръвта трябва да се покаже графично и след това да се интерпретира.
Гликиран хемоглобин умира
наличен в търговската мрежа комплект реактиви, съдържащ готова за употреба суспензия на слабо кисел катионен обменник. Целта е да се определи количеството гликозилиран хемоглобин в собствената кръв, както и в проба с повишена стойност (диабетна кръв).
ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ И ПРОТОКОЛ ЗА ИЗПИТВАНЕ
Донеси списък: халат, калкулатор
Пригответе пет епруветки Eppendorf с по 0,5 ml хлорна киселина (0,35 mol/l) всяка. След 30, 60 и 90 минути 0,05 ml капилярна кръв се отстраняват от върха на пръста с помощта на капилярна пипета и капилярът се поставя в епруветките на Eppendorf с хлорна киселина и се разклаща добре (депротеинизиране!). След като вземе 0,05 ml капилярна кръв, за да определи стойността на глюкозата в кръвта на гладно (проба 1), изпитваното лице изпива разтвор от 75 g глюкоза в 300 ml сок. Часът се регистрира. 10 минути след като последната проба е взета и депротеинизирана с хлорна киселина, тя се центрофугира в продължение на 4 минути при максимална скорост. Супернатантите се декантират внимателно, прехвърлят се в нови епруветки на Eppendorf и се центрофугират отново в продължение на 4 минути. Супернатантите се използват за определяне на кръвната глюкоза (раздел В.3.). Моля, маркирайте съдовете с номера на групата, както и номера на пробата и предайте останалите проби на асистента след теста!
Глюкозен реагент: Глюкозната оксидаза (GOD) окислява глюкозата до глюконова киселина с образуването на H2O2. Водородният пероксид окислява донора на водород (фенол и 4-аминофеназон) до багрило D в реакция, катализирана от пероксидаза (POD):
БОГ глюкоза + H2O + O2 глюконова киселина + H2O2
Количеството образувано багрило D е мярка за количеството преобразувана глюкоза. Тъй като коефициентът на моларна екстинкция на D зависи от експерименталните условия, измерената екстинкция (дължина на вълната 500 nm) е свързана с екстинкцията на стандартна стойност на глюкозата.
Извършване на определяне на кръвната захар
Необходимите решения са на работната маса: I:
Глюкозен реактивен фосфатен буфер, 0,10 mol/l, pH = 7,0; 50 µg хромоген (0,75 mmol/l фенол и 0,25 mmol/l 4-аминофеназон); > 1,5 KU/l POD; > 15 KU/l БОГ; > 2.0 KU/l мутаротаза
Глюкозен стандарт (5,55 mmol/l).
Разредете 50 μl от нивото на глюкозата в 0,5 ml перхлорна киселина. Използвайки подготвените проби (раздел В.1.), Пригответе партидите съгласно следната таблица, разбъркайте добре и оставете да престои 10 минути при стайна температура.
Калибрирайте фотометъра при 500 nm, определете абсорбцията на еталона и пробите спрямо празната стойност.
Гликиран хемоглобин 1.
Вземане на кръв и приготвяне на хемолизата: поставете 200 µl реагент за хемолиза в съд на Eppendorf (Eppi), обозначен с „E“; Вземете кръв с 50 µl капилярна пипета; Незабавно добавете напълнения капиляр към Eppi и разбъркайте добре, така че кръвта да се измие; Оставете да престои 5 минути.
Подход HbA1 Подходите се правят паралелно с хемолизати от стандартна кръв (Eppi "S"), автоложна кръв (Eppi "E") и диабетна кръв (Eppi "D"). Разклатете енергично хемолизата преди пипетиране! Пипетирайте 100 µl хемолизат във всяка от йонообменните епруветки; Етикетирайте епруветките ("S", "E" или "D") и поставете сепаратори (оставете около 1 см над течността); Инкубирайте 5 минути и разклащайте енергично на интервали от една минута; Изцедете внимателно течността с сепаратора и измерете абсорбцията [intPoint 4 (E1)].
Обща партида Hb В три паралелни партиди 20 μl хемолизат "S", "E" или "D" се поставят в епруветка с 5 ml дестилирана вода. смесени. (Не забравяйте буквите)! Оставете да престои 5 минути и след това измерете абсорбцията [intPoint 4 (EG)]
Измерване на изчезване на кръвните проби при = 405 nm (фотометърът се настройва спрямо вода).
Тест за толерантност към глюкоза (провеждане на експеримента) Кратка версия Извършете веднага точки 1-4, след това прочетете ! Експеримент 1 1) 2) 3) 4)
Добавете 500 µl хлорна киселина към 4 Eppis (с етикет 0.30, 60.90 мин.) И вземете кръв. Използвайте капиляр за това. (Капилярът трябва да е пълен, без въздушен мехур) Хвърлете капиляра в съда с времето „0 минути“ и веднага разклатете добре. Пийте кола, запишете часа.
Експеримент 2: Може да се извърши по всяко време (времето 30 или 60 минути от експеримент 1 е подходящо).
Част Б) 21) Напълнете три епруветки всяка с по 5 мл вода (с надпис „E“, „S“, „D“) 22) От Eppis („E“, „S“, „D“) по 20 µl хемолизат във всяка епруветките, пълни с вода
дай. 23) Разбъркайте добре и оставете да престои 5 минути. 24) Измерете абсорбцията отново срещу вода при 405 nm.
След почистване, моля, не изхвърляйте епруветките с глюкозен стандарт, глюкозен реагент и реагент за хемолиза. Всички останали съдове за проби се изхвърлят в предоставените съдове за отпадъци от кръв.
ОЦЕНКА И ДИСКУСИЯ ЗА ГРЕШКИ
Тест за толерантност към глюкоза Въведете измерената абсорбция и резултатите от определянето на глюкозата в следващата таблица и начертайте кривата. Как тълкувате резултатите?
5Е500 концентрация на глюкоза в кръвта (mmol/l)
Концентрацията на глюкоза в кръвта се изчислява, както следва:
Гликолизиран хемоглобин Въведете измерената абсорбция в следващата таблица, определете фактора F и изчислете процента на фракцията HbA1 в общия хемоглобин на автоложна и диабетна кръв. Делът на HbA1 в стандартната кръв е 6,8%.