PDF 3 Материал и методи - Безплатно изтегляне на PDF
Кратко описание
1 3 Материал и методи 3.1 Експериментално устройство, животински материали, отглеждане и хранене В две експериментални серии .
Описание
Експериментална настройка, животински материал, отглеждане и хранене
Влиянието на храносмилателния вискозитет върху морфологията и хистологията на тънките черва на свинете е изследвано в две пробни проби. За тази цел бяха сформирани контролна група и тестова група, състояща се от по шест прасета. В първия пробен период се подава полусинтетична дажба на базата на царевично нишесте и изолат от соев протеин (диета С). За да се увеличи храносмилателният вискозитет, 2% от кристалната целулоза е заместена с високо вискозен моделен субстрат карбоксиметил целулоза (диетична CMC). При второто тестово хранене се хранеше диета, която се състои главно от ръж и пшеница и по този начин съдържа естествени фактори, повишаващи вискозитета (диета К). Вискозитетът на дигеста на тестовата група (диета Е) беше намален чрез добавяне на ксиланаза-съдържащ ензимен препарат (Zy 68; 480 IU/kg фураж). Таблица 1 показва съставите на различните диети; Таблица 2 показва съдържанието на хранителни вещества и съответните вискозитети на екстракта.
Таблица 1: Състав на полусинтетичните диети C и CMC, както и диетите на зърнена основа K и E.
Компоненти [g/kg uS] царевично нишесте ръж пшеница соев протеин изолат целулоза, кристален1 карбоксиметил целулоза 2 глюкоза соево масло монокалциев фосфат фураж вар, въглена киселина премикс3 калиев хидроген карбонат магнезиев оксид лизин метионин треонин триптофан Zy 684
680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 0,4
1Viva Pur ® тип 200; Rettmaier & Sons pulp works, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Cuxhaven; Съдържание на kg: 1,2 милиона IU Vit A; 120 000 IU Vit D3; 4 g Vit E; 200 mg Vit B1; 600 mg Vit B2; 2500 mg ниацин; 400 mg Vit B6; 4,5 mg Vit B12; 20 mg биотин; 1800 mg пантотенова киселина; 160 грама натрий; 50 грама магнезий; 10 грама цинк; 7,5 g желязо; 7,5 g манган; 150 mg йод; 70 mg кобалт; 40 mg селен 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Cuxhaven; Zy 68 съдържа 1192 IU ксиланазна активност на g
Материал и методи Таблица 2: Анализирани и изчислени хранителни съставки на полусинтетичните диети С и CMC, както и на зърнените диети К и Е.
Сухо вещество Суров протеин Сурова мазнина Пепел Сурови влакна NfE NDF ADF Общо NSP1 (разтворим)
900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *
896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4 692,3 * * *
Арабиноза (разтворим) Ксилоза (разтворим) Маноза (разтворим) Глюкоза (разтворим) Галактоза (разтворим) Конвертируема енергия [MJ/kg uS] 2 Привидно точно смилаем суров протеин3 Вискозитет на екстракта [mPas]
901,9 131,9 32,9 51,3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4
898,9 131,9 31,4 49,7 17,3 668,6 134,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4
1, определено, както е описано в Bartelt et al. (2002) 2изчислено според енергийното съдържание на отделните компоненти (DLG, 1991) 3изчислено според информацията за съдържание и смилаемост за суров протеин в изолат от ръж, пшеница и соев протеин в CVB (1996) и Grala et al. (1998) 4 не отговаря на съдържанието на кристална целулоза * в диетата
24-те изпитвани животни са прасета от програмата на Шауман. В тази програма за размножаване се използват кръстоски от породата немски ландрас и дюрок като язовирна линия, а кръстоски от породи ландрас В и Хемпшир се използват като баща. Всички прасенца получиха инжекция желязо-декстран на тридневна възраст; мъжете са кастрирани на 15-ия ден от живота. Шест прасенца бяха избрани на случаен принцип от две едновременни котила, независимо от пола, и отбити на 28-ия ден от живота. Шестте кученца са разпределени равномерно между контролната и тестовата група (C или CMC или K или E). Периодът на хранене продължи три седмици и в двата тестови проби. Прасетата бяха настанени в отделни боксове с подова площ от 1,20 х 1,60 м с изцяло решетъчен под. Имаше визуален контакт между съседните кутии. Прасетата от различни групи не са имали пряк контакт. 29
Храненето се извършваше всеки ден в 8:00 ч. И 16:00 ч., Като подобен на брашно фураж се смесваше с трикратно количество вода. Количеството на дажбата е адаптирано към приема на фураж ad libitum, така че да е 100 g през първия ден и средно 1100 g през последния ден от експеримента. Преди следобедното хранене кутиите се почистваха с вода всеки ден. През това време три кутии от всяка фуражна група бяха свързани помежду си. Общото състояние на свинете се проверяваше ежедневно. През трите седмици на експеримента прасетата разполагаха с различни играчки като топки, заоблени метални пръти или пластмасови дискове. Животните се претеглят както в началото на експеримента, на 28-ия ден от живота, така и един ден преди края на експеримента.
след това се отваря надлъжно и накрая се изплаква три пъти в хладен физиологичен разтвор на натриев хлорид. Чревните части се разстилат върху хартиени кърпи за измерване на дължината и се оставят там да изсъхнат за около пет минути. След това отделните секции бяха претеглени. Всички отделни стъпки бяха извършени от едно и също лице. По време на цялата процедура беше обърнато внимание на особеностите и макроскопски разпознаваемите, патологични процеси. Теглото и дължината на отделните чревни секции спрямо телесното тегло се изчисляват по-късно във времето от параметрите на теглото и дължината на отделните чревни секции. Освен това, коефициентът на дължина и тегло е записан като мярка за дебелината на стената на тънките и дебелите черва.
Измерване на вискозитета на усвояване
Отстранената дигеста се охлажда в лед веднага след получаването й, докато пробите се центрофугират при 13 000 об/мин (относително центробежно ускорение 13600 g) в продължение на 10 минути (центрофуга тип 5415 С от Епендорф, Германия). Вискозитетът на 0,5 ml супернатант се определя с помощта на вискозиметър (тип LVDV II; тип конусна шпиндел с измерваща глава CP-40; закалено до 40,0 ° С, Brookfield, САЩ). Ако беше наличен достатъчно материал за проба, бяха извършени двойни измервания. При пет животни по време на вземането на проби в илеума не е имало дигеста.
За фиксиране (20 часа при стайна температура) в модифициран разтвор на Bouin (4% пикринова киселина + 2,5% меден ацетат + 3,5% формал) пробите от тъкани се опъват върху коркови плочи с таралежи. Това беше последвано от няколко изплаквания със 70% етанол за период от 24 часа. Препаратите бяха допълнително дехидратирани за общо 48 часа с помощта на нарастваща алкохолна поредица (4 пъти 2 часа 80%, 30 минути 90%, 2 пъти 30 минути 96%, 4 пъти 1 час 100% етанол; избистряне с ксилол I, II и III 20 минути всеки път; всеки път при стайна температура). След къпане в мек парафин с точка на топене 46 ° C, пробите се влагат в твърд парафин при 60 ° C (точка на топене 57 ° C).
Проби от тъкани с размер около 1,5 cm², опънати върху коркови плочи, се фиксират за 24 часа в следния разтвор: 2% параформалдехид + 2,5% глутаралдехид в 0,1 М какодилатен буфер, рН 7,2. След това те се изплакват няколко пъти с буфер за изплакване, споменат в глава 3.4.2, и след това се фиксират със съответния разтвор на осмиев тетроксид за 2 часа при стайна температура. След многократно изплакване пробите се измиват с възходяща поредица алкохоли (2 пъти 30 минути 50 и 70%; 30 минути 80% етанол I, 16 часа 80% етанол II, 2 пъти 30 минути 90 и 96% и 4 пъти 30 минути 100 % етанол; всеки при 4 ° C) дехидратиран. Това беше последвано от 2-часово третиране с HMDS (1-1-1-3-3-3 хексаметилдисилазан; Roth 3840.2) при стайна температура, преди препаратите да се изпарят за една нощ (стайна температура). След като препаратите бяха залепени върху плочи за проби с помощта на проводящ калай (Plano), те се съхраняваха във вакуумен шкаф до разпрашаване (една минута; Sputter Coater S150B, Edwards Company, Англия).
Преглед на оцветяването, както и доказателства за пролиферация и апоптоза за светлинна микроскопия
За морфологични и морфометрични изследвания, участъци с дебелина 5 µm бяха оцветени с хематоксилин-еозин (HE). В допълнение, участъци със същата дебелина се оцветяват с периодично киселинен Schiff реактив Alzian blue (PAS-AB), рН 2.5. Използваните тук багрила оцветяват по различен начин лигавичните вещества (муцини) в бокаловите клетки в зависимост от стойността им на pH. От една страна, това значително опростява идентифицирането на бокаловата клетка; от друга страна, киселинните муцини са показани в синьо, докато неутралните муцини са показани в червено (Romeis, 1989). По-нататъшно диференциране на муцините не е направено. За да се определи степента на разпространение и апоптоза, бяха проведени специални доказателства, които са описани по-долу поотделно.
Откриване на пролиферативно активни клетки
Принцип на метода за откриване Тимидиновият аналог бромодезоксиуридин (BrdU) се прилага интраперитонеално на прасетата за един час ante mortem при концентрация 15 mg/kg живо тегло. През този час промененият уридин беше включен в техния генетичен материал от клетките в S фазата на клетъчния цикъл. Вграденият BrdUridine е маркиран с моноклонални антитела от мишка. Свързаните първични антитела стават видими с пероксидазно-антипероксидазния метод (PAP), имуноглобулин от заек, служещ като свързващо антитяло (Romeis, 1989). Сърцевините, съдържащи BrdU, изглеждат кафяви.Реагентите, използвани за това, са както следва: SILANES: Плъзгачите са покрити съгласно инструкциите на Sigma A3648. TBS I: промивен буфер I (TRIS-буфериран физиологичен разтвор); 0,1 М TRIS + 0,1 М NaCl + 0,05 М MgCl; рН 7,5 Инкубационен буфер: 0,05 M TRIS + 0,9% NaCl + 0,66 mM MgCl2 + 1% BSA + 0,1% желатин (Merck 4078) TBS II: промивен буфер II; 0,05 M TRIS + 0,9% NaCl; рН 7,6 трипсин: 0,1% + 0,1% CaCl2 в TBS I (рН 7,6 до 7,8) SwNS: нормален свински серум (DAKO X 0901); за преинкубация 20% в реактиви за откриване на TBS I (инкубация): Инкубация I: MaBrdU (DAKO M 07444; миши моноклонални антитела срещу BrdU); 1:25 в инкубационен буфер + 2% SwNS 33
Инкубация II: RaMIg (DAKO Z 0259; антитела на заек срещу имуноглобулини на мишката); 1:40 в инкубационен буфер + 2% SwNS инкубация III: мишка PAP (DAKO B 0650); 1: 250 в инкубационен буфер + 2% SwNS BSA:
говежди серумен албумин (Roth 8076.2)
Принципи на методите за откриване По време на апоптозата характерни ДНК фрагменти възникват от активността на собствените клетъчни ендонуклеази. Една от възможностите за хистологично откриване на тези фрагменти е тази на Gavrieli et al. (1992) описва TUNEL метод (терминално дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) -медифицирано dUTP-биотин никелно маркиране). Той се основава на специфичното свързване на ензимната терминална деоксинуклеотидил трансфераза (TdT) към 3'-OH краищата на ДНК. Този ензим свързва белязани с биотин деоксиуридин трифосфати (биотин-dUTP) с краищата на ДНК фрагментите. В крайна сметка биотинът се прави видим според метода PAP. Използваният тук стрептавидин-биотин комплекс, към който химически се свързват пероксидази, замества антителата (Gavrieli et al., 1992). При друг метод се открива наличието на ензим, типичен за апоптоза, каспаза-3. Ензимите в цитоплазмата се маркират с помощта на специфично антитяло от заек. Първичните антитела се правят видими с помощта на вече споменатия метод PAP. Мостовото антитяло, използвано в този случай, идва от коза.
Реагентите, използвани за TUNEL, са както следва: TBS: 0,05 M TRIS-HCl (рН 7,6) + 0,9% NaCl TdT буфер: 30 mM TRIS + 140 mM Na какодилат + 1 mM CoCl2; рН 7,2 TB буфер: 0,3 М NaCl + 0,03 М Na цитрат; pH 8,0 Биотин-dUTP: Boehringer 1093 070, оригинален разтвор (50 nM/50 µl), разреден 1:10 с PBS; използван разтвор 5 nM/50 µl (съхранява се на порции при -20 ° C) TdT:
Boehringer 220 582, тимус на теле; Оригинален разтвор (500 U/20 µl), разреден 1:25 с 50% глицерол в PBS; използван разтвор 500 U/500 µl (съхранява се на порции при -20 ° C)
Говежди серумен албумин (Roth 8076.2; съхранение при 4 ° C)
SABC-KIT: Стрептавидин-биотинов комплекс (DAKO K0377; съхранение при 4 ° C) DAB: 37,5 mg диаминобензидин/150 ml TBS + 70 µl H2O2 30% протеин киназа; FLUKA 82456; 5, 10, 15, 20, 50 или 100 µl/ml TBS DNAse: 0,5 U/µl (Boehringer Mannheim, 776785) Процедура Парафиновите срезове с дебелина 3 µm се изтеглят върху подходящи предметни стъкла и се накисват за откриване на пролиферация. След това препаратите се избелват в метанол с 0,3% водороден прекис (30 минути) и след това се изплакват с двойно дестилирана вода. За 35-и
Следните реагенти бяха използвани за откриване на каспаза-3: цитратен буфер: 0,01 М; рН 6,0 PBS: буфериран с фосфат физиологичен разтвор; без йони Ca и Mg; pH 7,4 BSA: говежди серумен албумин (ROTH 8076,2; съхранение при 4 ° C) NSfS: нормален овчи серум (DAKO X0503; съхранение при 4 ° C) ЦНС: козе нормален серум (DAKO X0907; съхранение при 4 ° C) зайци -Серум: DAKO X0902; Съхранение при 4 ° C DAB: 20 mg диаминобензидин/100 ml PBS + 25 µl H2O2, 30%; рН 7,6 Използвани антитела: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (антитяло на заек срещу човешка каспаза-3); 1: 100 в PBS + 2,5% CNS + 0,1% BSA (съхранение при 4 ° C.) GaR-Ig: DAKO Z0421 (антитела на коза срещу имуноглобулини на заек); 1:20 в PBS + 1% BSA (съхранение при 4 ° C.) Rabbit-PAP: DAKO Z113; 1:40 в PBS + 1% BSA (съхранение при 4 ° C)
Светлинно и електронно микроскопско изследване
Светлинните микроскопски изследвания бяха извършени с помощта на аксиоскоп от Zeiss, Германия. При изследване на HE-оцветените участъци, особено внимание беше обърнато на формата на ворсите, хода на криптата и индикациите за появата на апоптоза. Оцветените с PAS-AB (pH2.5) срези бяха оценени по отношение на разпределението на бокаловите клетки и настъпващите стойности на рН на муцин. Преди да се оценят образците, върху които са извършени конкретните доказателства (пролиферация и апоптоза), специфичността на метода първо се проверява, като се използват положителните или отрицателните контроли. Впоследствие беше обърнато специално внимание на появата и местоположението на структурите, които трябва да бъдат открити. Изследването със сканиращ електронен микроскоп е извършено на устройство от Bausch & Lomb, Канада, тип Nanolab 2000. Оценката на транселектронните микроскопични проби се извършва на устройство EM 10 CR от Zeiss, Германия.
най-накрая се изразява в броя на пролиферациите на mm обиколка на криптата. В допълнение, общото количество на активно разделящи се епителни клетки в рамките на определен участък от лигавицата се изчислява чрез умножаване на относителната скорост на пролиферация със съответния коефициент на увеличение на повърхността на лигавицата, причинена от образуването на крипта. Получената стойност изразява колко пролиферации присъстват в епитела на криптата в рамките на определена дължина на lamina muscularis mucosae. Накрая беше изчислен индексът на обновяване на епитела. За тази цел се определя общото количество на активно делящи се епителни клетки спрямо размера на повърхността на вили. Индексът на обновяване показва колко нови епителни клетки възникват по отношение на повърхността на вилуса [пролиферация/mm повърхност на вили].
Всички параметри бяха определени за всяко прасе и във всичките три участъка на червата. В отделни случаи взетите проби бяха неизползваеми. Средната стойност се формира от стойностите на един и същ параметър, които се записват няколко пъти за всяко животно и всяка секция. За да обобщим шестте прасета в група, също беше определена средната аритметична стойност. Сравненията на отделните параметри между групите бяха извършени с помощта на двуфакторен дисперсионен анализ. Нивото на значимост е 0,05. За да се вземат предвид ефектите на отпадъците, факторът “Litter” е вложен във фактора “Group”. След това беше извършен тест за доброта на годност на Колмогоров-Смирнов със стандартизираните остатъци, за да се провери съществуването на нормално разпределение. Може да се приеме нормално разпределение за всички параметри. За да се изследват разликите в параметрите между отделните участъци на тънките черва, първо бяха осреднени стойностите на всички прасета. След това беше извършен t-тест за сдвоени проби, като нивото на значимост също беше 0,05. Анализите са извършени с помощта на компютърната програма SPSS за Windows, 9.0.1, 1999.