От Института по животновъдство и развъждане на Университета в Хохенхайм, Катедра по животновъдство и
От Института по животновъдство и селекционен университет на Хохенхайм Предметна област: Животновъдство и физиология на производителността проф. Д-р Р. Клаус Повишаване на образуването на бутират чрез хранене на устойчиво нишесте при прасета: Последици от регулацията на митозата и апоптозата на лигавицата на дебелото черво Дисертация за придобиване на степен доктор на земеделските науки, представена пред Факултета по земеделски науки от Йоахим Менчел от Ландсхут 2004
От Института по животновъдство и селекционен университет на Хохенхайм Предметна област: Животновъдство и физиология на производителността проф. Д-р Р. Клаус Повишаване на образуването на бутират чрез хранене на устойчиво нишесте при прасета: Последици за регулацията на митозата и апоптозата на лигавицата на дебелото черво Дисертация за придобиване на степен доктор на земеделските науки, представена пред Факултета по земеделски науки от Йоахим Менчел от Ландсхут 2004
Настоящата работа е приета на 12 март 2004 г. от Факултета по аграрни науки към университета в Хохенхайм като дисертация за придобиване на степен доктор на земеделските науки. Ден на устния изпит: 25 март 2004 г. 1-ви заместник-декан: проф. Д-р К. Стар Докладчик, 1-ви изпитващ: проф. Д-р Р. Клаус Съдокладчик, 2-ри проверяващ: проф. Д-р Х. Шенкел 3-ти изпитващ: проф. Д-р Р. Мосентин
Преглед на литературата 2 Преглед на литературата 2.1 Преглед на храносмилателната система на прасето Храносмилателната система на прасето е разделена на главата и багажника. Червата на главата се състои от носната, устната и фарингеалната кухини. Багажникът може да бъде разделен на предно черво (хранопровод и стомах), средно или тънко черво (дванадесетопръстник, йеюнум и илеум), ректума или дебелото черво (цекум, дебело черво и ректума) и ануса (Liebich, 1998). Структурата на червата на багажника е показана схематично на фиг. 1. Фиг. 1: Схематично представяне на червата на багажника при свинете (след Koch и Berg, 1990) 2I
Преглед на литературата Дължината на цялото черво при прасетата е 20-27 м, около 15 пъти дължината на тялото. Дуоденумът е с размери около 0,95 м, а цялото тънко черво с йеюнум и илеум - около 15-20 м. Дължината на дебелото черво е около 6 м, а на дебелото черво около 5 м (Loeffler, 1991; Bucher & Wartenberg, 1991). 2.1.1 Морфологични принципи на стомашно-чревния тракт и неговите особености Всички отдели на червата на багажника имат сходен основен план (Liebich, 1998), но има значителни разлики по отношение на структурата на стените им (Фиг. 2). Тънките черва се състоят от множество крипти и вили. Криптите са по-къси от тези на дебелото черво. За разлика от тях, в дебелото черво няма ворсинки. Характерно е образуването на крипти (glandulae intestinales), те са неразклонени и близо една до друга. Собствените му храносмилателни ензими не се отделят от лигавицата на дебелото черво. Освен това дебелото черво има способността да отделя слабо разтворими вещества като метали. Освен това, за разлика от тънките черва, не само перисталтичните, но и антиперисталтичните движения са физиологични в дебелото черво (Bucher & Wartenberg, 1991). Фигура 2: Различни стенни структури на тънките черва и дебелото черво (след Potten, 1992) 3
Преглед на литературата 2.1.2 Морфологични особености на дебелото черво Дебелото черво се развива по време на ембриогенеза от средата и ректума. Възходящото дебело черво и проксималното напречно дебело черво се развиват от средното черво, а дисталното напречно дебело черво и низходящото дебело черво възникват от ректума. В допълнение към това различно развитие има и физиологични различия в храносмилането, така че основното място на ферментация е в проксималната област, но може и да се измести дистално в зависимост от поетия субстрат. Освен това, храносмилателната пулпа все повече се удебелява в дисталната област. Поради тези причини дебелото черво е посочено като проксимално и дистално дебело черво в тази статия. Проксималната част се състои от възходящото дебело черво и проксималната област на напречното дебело черво, дисталната зона на дисталното напречно дебело черво и низходящото дебело черво. 2.1.2.1 Обща стенна конструкция на дебелото черво Основният конструктивен план на дебелото черво се състои от различни слоести тъкани (фиг. 3); от лумена към външната страна те се наричат tunica mucosa, tela submucosa, tunica muscularis, tela subserosa и tunica serosa. Фиг. 3: Напречно сечение през дебелото черво (Liebich, 1998) 4I
Преглед на литературата 2.2 Задачи на стомашно-чревния тракт Основната задача на стомашно-чревния тракт е да разгради погълнатата храна до нейните компоненти до такава степен, че тя да може да се абсорбира в тялото. Храносмилателният процес започва с механично разграждане на хранителните компоненти в устната кухина. След поглъщане на храната, въглехидратите, протеините и мазнините се усвояват. Храносмилането в средното черво се осъществява чрез ензими. Преглед на собствените ензими на организма по време на разграждането на основните хранителни вещества е даден на фиг. 5. Фигура 5: Преглед на собствените ензими на тялото по време на разграждането на основните хранителни вещества (според Simon, 1995) Ефективността на тънкочревните ензими в дебелото черво намалява непрекъснато. Вместо това чревните бактерии и протозои, които разграждат въглехидратите и протеините, поемат храносмилането на останалите хранителни компоненти в дебелото черво. В допълнение към усвояването на минерали и вода, задачите на дебелото черво са синтеза на витамини В и К и главно 7
Преглед на литературата Таблица 3: Моларни съотношения на ацетат, пропионат и бутират след инкубация на човешки изпражнения с различни въглехидрати в продължение на 24 часа (съгласно Cummings & Macfarlane, 1997) Добив на субстрат на SCFA (%) Моларни съотношения (%) ацетат пропионат бутират нишесте 49 62 15 23 трици (пшеница, 40 64 16 20 овес) фруктоолигозакарид - 78 14 8 пектини 39 80 12 8 други NSP 38 63 22 8, включително: гуарова гума арабиногалактан 62 43 59 57 27 31 11 11 хранителни компоненти като целулоза, хемицелулози, пентозани (Berggren et al., 1993; Bourquin et al., 1993; Knudsen et al., 1993) водят до лека бутиратна ферментация, докато се постигат повишени концентрации на бутират, особено при устойчиви нишестета. Таблица 4: Моларни съотношения на ацетат, пропионат и бутират след 24 часа инкубация на свински фекалии с различни нишестета (съгласно Martin et al., 1998) Субстратни моларни съотношения (%) ацетат пропионат бутират сурово пшенично нишесте 56 25 17 сурово царевично нишесте 62 21 16 сурово грахово нишесте 62 21 15 сурово амилома царевично нишесте 47 28 23 ретроградирано 54 28 14 амилома царевично нишесте сурово картофено нишесте 55 19 25 11
Преглед на литературата за поддържане на тъканната хомеостаза. Тя е тясно свързана с митозата, тъй като ако броят на клетките в тъканта остане същият, се образуват точно толкова клетки, колкото са загубени чрез клетъчна смърт (Kerr et al., 1972). Съответно, добре дефинирани механизми за регулиране на клетъчната загуба трябва да съществуват в тъкани с постоянно клетъчно производство (Ansari & Hall, 1992). Техните задачи са да премахват излишните, повредени или заразени клетки (Томпсън, 1995). Грешките в апоптозата могат да доведат до различни клинични картини. Ако митотичната скорост остане същата, увеличаването води до атрофия на тъканите. От една страна, активирането на проапоптотични контролни механизми може да доведе до дегенерация на тъканите (Que & Gores, 1997), от друга страна, грешките в апоптозата улесняват трансформацията на нормалната тъкан в неопластична тъкан. Поради тези причини се обсъждат фармакологични стратегии по отношение на влиянието върху апоптозата. По този начин инхибирането на апоптозата на епителните клетки може да подобри процесите на обновяване на тъканите и възстановяването в стомашно-чревния тракт, докато индуцирането на апоптоза в злокачествените тъкани може да има голяма терапевтична полза (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Клетъчно делене: митоза Процесът на клетъчно делене, чрез който се създава нова клетка със същия брой хромозоми като в оригиналната клетка, се нарича митоза. При митоза всяка хромозома се разделя на две равни части, които пътуват към противоположните краища на клетката. След клетъчното делене всяка от двете дъщерни клетки има същия брой хромозоми и гени като оригиналната клетка. Просто изградените едноклетъчни клетки и някои многоклетъчни видове се размножават чрез митоза; В допълнение, живите същества растат чрез този процес (хиперплазия) и използваните клетки се заменят. Това е за разлика от клетъчния растеж (хипертрофия), което трябва да се разбира само като увеличаване на клетъчната маса или размера на клетките. В лигавицата на стомашно-чревния тракт ентероцитите винаги излизат от стволови клетки, които са разположени в долните области на криптата (Bach et al., 2000). За да се идентифицира пролиферираща клетка, трябва да бъдат открити специфични промени, като генни продукти, които са свързани с пролиферацията. Представители на тези гени, свързани с пролиферацията, включват: а. обсъди онкогените. Хронологичният клетъчен цикъл (фиг. 7) е от голямо значение за идентифициране на митозата. Това е разделено на четири фази (G1, S, G2 и M). По време на S Pha- 14 I
Прегледът на литературата se извършва ДНК синтеза, по време на М фаза митоза с разделяне на хромозомите. Във фази G1 и G2 (междинни фази) се извършва подготовката за процесите в следващите фази S и M. Клетките, които не преминават през клетъчния цикъл, са във фаза G0. Начало на митоза MR G2 G0 G1 S Начало на синтез на ДНК Фиг. 7: Схематично представяне на клетъчния цикъл Откриването на митоза може да се определи чрез определени маркери като PCNA (пролифериращ клетъчен ядрен антиген) и чрез откриване на ядрен антиген (Ki67) (Potten & Loeffler, 1990). PCNA протеинът се синтезира в делящи се клетки. Антителата, насочени срещу този протеин, реагират с делящи се клетки, включително туморни клетки, но не и с клетки във фаза на покой (Mathews et al. 1984). Антитялото Ki67 открива ядрен антиген, който присъства в пролифериращите клетки, но не и в останалите клетки. Клетките в циклични фази, включително G1, са Ki67 положителни, докато клетките във фазата G0 не експресират антигена (Baisch & Gerdes 1990). 15-ти
Преглед на литературата Фиг. 10: Схематично представяне на апоптозата (според Kerr, 1993) 2.4.4.2 Курсът на апоптоза Апоптозата може да бъде инициирана с помощта на различни контролни механизми (Фиг. 11). В този контекст трябва да се прави разлика между медиирания от рецептора път на апоптоза и митохондриалния път. 21-ви
Преглед на литературата Рецептор-медиираният път на апоптоза се инициира чрез рецептори като CD95. Свързването на CD95 лиганд с CD95 индуцира сигналния комплекс, който набира молекули прокаспаза 8 посредством FADD (Fas асоцииран протеин на домена на смъртта) и по този начин е отговорен за активирането на каспаза 8 (Hengartner, 2000). Митохондриите играят централна роля в контрола на апоптозата. Митохондриалният път може да бъде задействан от извънклетъчни фактори или увреждане на ДНК. Протеините от семейството Bcl-2 участват в този регулаторен механизъм. Про- и антиапоптотичните представители на това семейство влизат в контакт в митохондриите и контролират освобождаването на различни молекули като цитохром с, които заедно с апаф-1 и прокаспаза 9 могат да доведат до активиране на ефекторните каспази. Допълнителни подробни механизми, показани на диаграмата, не се обсъждат допълнително в тази работа; по-подробни обяснения могат да бъдат намерени в публикацията на Hengartner (2000). Фиг. 11: Схема на най-важните пътища на апоптоза (вляво: рецептор-медииран път на апоптоза; вдясно: митохондриален път на апоптоза, според Hengartner, 2000) 22 I.
Преглед на литературата Членове на семейството bcl-2 Mitochondrion освобождаване на цитохром c Активиране на каспазната каскадна апоптоза Фиг. 12: Модел на апоптозната каскада чрез Bcl-2, митохондрии, цитохром c и каспази 2.4.5.1 Регулиращи апоптозата протеини: Bcl-2 семейство Bcl-2 се използва като протоон идентифицирани. Генът е открит за първи път при В-клетъчен лимфом. Експериментите върху миши клетъчни линии също показват ефект на bcl-2 върху апоптозата (Vaux et al., 1988). Докато Bcl-2 се намира в много фетални тъкани, в възрастните тъкани този протеин се изразява главно в бързо делящи се и диференциращи се клетки. При по-нататъшни изследвания бяха открити редица гени, които имат хомологии на последователността с bcl-2 (Yang & Korsmeyer, 1996; Reed, 1997). Характеризирането на аминокиселинната последователност, биологичния ефект и функция доведе до различни наблюдения. Съответно, семейството на протеини Bcl-2 включва както Ver 25
Преглед на литературата Bcl-2, Bcl-X-L, Bid или вие сами (Sattler et al., 1997). Bax противодейства на антиапоптотичния протеин Bcl-2; колкото по-високи са концентрациите на Bax в сравнение с Bcl-2, толкова по-голям е ефектът му. Относителните съотношения на Bax/Bax хомодимери, Bcl-2/Bax хетеродимери и Bcl-2/Bcl-2 хомодимери са от решаващо значение за изпълнението на апоптозата. Ако Bax хомодимерите преобладават, тогава настъпва клетъчна смърт; преобладаването на Bax/Bcl-2 хетеродимери има тенденция да води до оцеляване на клетките (Sato et al., 1994). Въпреки това, някои проучвания също показват, че независимо от степента на димеризация, Bcl-2 и Bcl-x могат да инхибират апоптозата или че Bax също може да насърчи апоптозата (St Clair et al., 1997; Zha & Reed, 1997) (Фиг. 13). В допълнение, проапоптотичният ефект на Bak изглежда е независим от хетеродимеризацията с Bcl-X-L и Bcl-2 (Simonian et al., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: Фиг. 13: Диаграми, показващи протеиново-протеиновото взаимодействие на членовете на семейството bcl-2 (a: модифицирано от Mathers, 1998; b: Sato et al., 1994) 27