Оптимизиране на ефективността на ендотелната диференциация на човешки CD133 положителни стволови клетки -

1 От Медицинска клиника и поликлиника II на Онкологичния център на Университетския медицински център Хамбург-Епендорф Оптимизиране на ефективността на ендотелната диференциация на човешки CD133 положителни стволови клетки Дисертация за получаване на докторска степен по медицина в медицинския отдел на Хамбургския университет, представена от Естел Йонго от Камерун Хамбург 2008

ефективността

2 2 Приет от Медицинския факултет на Хамбургския университет на: Отпечатан с одобрението на Медицинския факултет на Хамбургския университет Изпитна комисия, председателят: Изпитна комисия, 2-ри рецензент: Изпитна комисия, 3-ти рецензент: проф. Д-р W. Fiedler проф. Д-р Х. Кабиш проф. Д-р Н. Крьогер

4 4 H ПРИЗНАВАНИЕ I ФЕДЕРАЛНА ДЕКЛАРАЦИЯ J СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ K СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА СПИСЪК НА ТАБЛИЦИТЕ

23 23 засегнати от хематопоетични стволови клетки. За тази цел някои от клетките трябва да бъдат поставени върху стъклосъдържаща почва. Друга възможност за увеличаване на степента на диференциация на хемопоетичните стволови клетки може да бъде постигната чрез диференциране на морфологично недиференцирани клетки, съдържащи се в супернатантите на медията. На въпроса дали неприлепналите клетки ще се диференцират ендотелно трябва да се отговори чрез заместване на тези клетки. Други източници на ендотелни клетки са CD14 положителните, моноцитни стволови клетки (Fernandez et al., 2000) и MNCs (Murasawa et al., 2002) .Те трябва да бъдат изолирани от левкафереза, от буфите и от костния мозък. Изследванията трябва да бъдат ограничени до количественото определяне на получените ендотелни клетки и тяхната имунохистохимична характеристика. И трите клетъчни типа, и прясно изолираните хемопоетични стволови клетки трябва да се сравняват помежду си по отношение на тяхното поведение на диференциация.

24 24 C Материал и методи 1 Материал 1.1 Лабораторно оборудване Раздел 1: Използвано лабораторно оборудване Източник на доставката Име на производителя Марка на устройството, Wertheim Neubauer преброителна камера Броячна камера Eppendorf, Хамбург Референтни 10, 100 и 1000 пипети Forma Scientific, Marietta (USA) Incubator Society с водна обвивка за GFL водна баня водна баня лабораторна технология, Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS стерилна работна маса центрофуга Hirschmann лабораторно оборудване, Pipetus батерия, помощ за пипетиране Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB с IM50 флуоресцентен софтуер Реверсиращ микроскоп Miltenyi BiotecMaticMachinMGMBG BiogcmagMicMacMicGMACM, Франкфурт Цитоспин 2 цитоцентрифуга Zeiss, Jena Axioplan Axiovert 25 Phomi 3 флуоресцентен инвертиран микроскоп инвертиран микроскоп/флуоресцентен инвертиран микроскоп микроскоп

25 Консумативи Таблица 2: Източник на консумативи Becton Dickinson, Franklin Консумативи Discardit II Стерилни спринцовки; 5, 10 и 20 ml езера (САЩ) BD Falcon, Хайделберг Стерилни еднократни пипети; 1, 2, 5, 10 и 25 ml плочки с клетъчни култури; Multiwell 6, 12, 24 или 96 ямкови клетъчни сита 40 μm центрофужни епруветки; 15 и 50 ml Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Bergisch Tubes: 15 и 50 ml реакционни съдове; 0,5 и 1,5 и 2,0 ml пастьорски пипети 230 mm, стъкло Steriflip (еднократна стерилизационна единица) MACS Разделителни колони LS и MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH & 30 µm клетъчни сита покриват стъкла Co.KG, Königshofen Lauda slide Sarstedt, Накрайници за пипета на Нюмбрехт (10, 100 и 1000 µl) Schott, Mainz Shandon Inc., Питсбърг (САЩ) Филтри от хартия за стъклени изделия за Cytospin 2 (филтърни карти дебели) VWR International, стерилни спринцовни филтри 0,45 и 0,22 µm (стерилен диетикон (Швейцария) филтър за спринцовка)

26 Химикали и медицински продукти Раздел 3: Използвани химикали и медицински продукти Източник на доставка Baxter, Munich Biochrom AG, Berlin Biotest, Dreieich Химически/медицински продукт ACD-A Biocoll Separating Solution (Ficoll) AB-Serum Human Serum Albumin (HSA) Cambrex, New Jersey (USA) EGM-2 Bullet Kit Fährhaus Handelsgesellschaft Hamburg Gibco, Karlsruhe Pharma mbh, хидрокортизон (HC) D-PBS Фетален телешки серум (FKS) Fungizone (Amphotericin B) Конски серум (HS) IMDM Penicillin-Streptomycin-Glutamine (EDTA) ) Harbor Bio-Products, Human Fibronectin (FN) Norwood (USA) JT Baker, Phillipsburg Ethanol Absolute (САЩ) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD133 Комплект за изолиране на клетки, човешки CD14 Micro Beads, човешки MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Минеаполис (САЩ) rhang-1 (Recombinant Human Angiopoietin-1) rhang-2 (Recombinant Човешки ангиопоетин-2) Трипанов син разтвор (0,4%) TEBU, Offenbach bfgf (основен фактор на растежа на фибробластите) EGF (епидермален растежен фактор) Flt-3-лиганд (Flt-3-l, свързана с Fms тирозин-киназа 3 лиганд)

27 27 HGF (човешки хепатоцитен фактор на растеж) IGF-1 (инсулиноподобен растежен фактор-I) IL-8 (интерлевкин-8 или производен от моноцити неутрофилен хемотактичен фактор) SCF (фактор на стволови клетки) SCGF-ß (фактор на растежа на стволовите клетки) -бета) VEGF (съдов ендотелен растежен фактор или рекомбинат на човешки VEGF165) 1.4 Антитела за анализи на имунофлуоресценция Таблица 4: Използвани антитела Човешка маркировка Изотип Клон Приложение Източник на доставка Антиген g CD144 - Мишка 55-7H1 Имун-BD Pharmingen, (VE- IgG 1 κ хистохимия Сан Диего (САЩ) Cadherin) FITC vwf (von- Sheep- - Immun- The Binding Site, Willebrand Anti- histochemistry Birmingham -factor) Human (UK) IgG Secondary Texas Red Goat- - Immun- Jackson Antibodies Anti- histochemistry ImmunoResearch, за CD144 Mouse West Grove IgG (САЩ) (H + L)

28 Състав на използваните буфери и среда Използвани цитокини и техните концентрации Таблица 5: Преглед на използваните фактори и техните концентрации Фактори Концентрация в получения разтвор (µg/ml) (ng/ml) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF концентрация основна среда и буферите AB-PBS -8 ml PBS -2 ml AB-Serum Erylyse Buffer (стерилен филтриран) -8.29 g NH4Cl (155 mm) -1 g KHCO3 (10 mm) -45,2 mg EDTA (0,1 mM) -1 L H20 EBM ml EGM-2 базална среда -10 ml FCS -1 ml пеницилин/стрептомицин (Pen/Strep) -100 µl амфотерицин Б.

29 29 EBM-1-80 ml EGM-2 базална среда -20 ml FCS -1mL пеницилин/стрептомицин (Pen/Strep) -100 µl амфотерицин B EBM-2-450mL EGM-2 базална среда -50 ml FCS -5 ml пеницилин/стрептомицин -2 ml rhfgf-bheparin -500 µl амфотерицин B -500 µl GA-1000 (гентамицин) -500 µl аскорбинова киселина (AS) -500 µl VEGF -500 µl R3-IGF µl хепарин -500 µl регф-200 µl хидрокортист; стерилен филтриран) -50 ml LBMCM (Дългосрочна среда за култивиране на костен мозък. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 µl SCGF-ß (10 µg/ml) -250 µl VEGF (10 µg/ml) -250 µl Flt3-l (10 µg/ml) основен разтвор на фибронектин (за покриване на плочите): -1 mg фибронектин (FN) -1 ml стерилна вода -24 ml PBS MACS буфер -475 ml PBS -12,5 мл човешки серумен албумин (HSA) -3 ml аква цитрат декстроза А (ACD-A) стоп среда (след трипсинизация) за ендотелни клетки: 20% FCS в EGM-2 базална среда или в супер среда

30 30 LBMCM -400 ml IMDM -50 ml Фетален телешки серум (FKS) -50 ml Конски серум (HS) -500 μl Хидрокортизон (HC) Трипсин основен разтвор: -1 ml Трипсин -9 ml PBS основна среда с добавка на цитокини като диференцираща среда -LBMCM като основна среда Таблица 6: Преглед на добавените цитокини Добавени цитокини VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HGF VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 като основна среда Таблица 7: Преглед на използваната Фактори и комбинации Добавени цитокини VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2