Нуклеозоми като параметри на клетъчната смърт при пациенти със злокачествени тумори - PDF безплатно изтегляне

От Института по клинична химия към Изпълнителния съвет на Ludwig-Maximilians-Universität München: проф. Д-р Д-р h.c. D. Нуклеозоми на Сейдел като параметри на клетъчната смърт при пациенти със злокачествени тумори Дисертация за придобиване на докторска степен по медицина в Медицинския факултет на Университета „Лудвиг Максимилианс” в Мюнхен, представена от Стефан Холденридер от Йетинген-Шепах 24

като

II С одобрението на Медицинския факултет на университета в Мюнхен 1. Докладчик: проф. Д-р Д-р h.c. D. Seidel 2-ри докладчик: проф. Д-р C. Nerl Съдокладчик: Priv. Доз. Р. Холе проф. Д-р J. P. Johnson Съвместно наблюдение от служителя на доктора: Dr. Петра Стийбър Дийн: проф. Д-р Д-р h.c. К. Петър Ден на устния изпит: 15.1.24

III Посветен на моите родители

IV Предварителни публикации: Заявка за патент: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A Проследяване на терапията при пациенти, при които апоптозата е индуцирана в резултат на заболяване или терапия, чрез откриване на апоптоза продукти. Патентен номер: 4918/OA/WO - Ts Оригинални статии: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Апоптоза в серума на пациенти със солидни тумори Anticancer Res. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D Нуклеозоми в серум като маркер за клетъчна смърт Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Нуклеозоми в серума на пациенти с доброкачествени и злокачествени заболявания Int J Cancer (Pred Oncol) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Циркулиращи нуклеозоми в серума Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Количествено определяне на нуклеозомите в серума чрез ELISA за откриване на клетъчна смърт плюс Biochemica 1 (22): 25-27

VI СЪДЪРЖАНИЕ 1 ВЪВЕДЕНИЕ И ВЪПРОСИ I 2 ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ 4 2.1 СМЪРТ НА КЛЕТКИ 4 2.1.1 ИСТОРИЯ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО НА КЛЕТКАТА СМЪРТ 4 2.1.2 ДИХОТОМЕН МОДЕЛ НА КЛЕТОВАТА СМЪРТ 1 2.1.3 ИНТЕГРИРАН МОДЕЛ НА СМЪРТ НА КЛЕТКИТЕ ВЪВ ФИЗИОЛОГИЧНИЯ ПРОЦЕС 21 2.1.5 6 ГЕНЕТИЧНО РЕГУЛИРАНЕ НА АПОТОТИЧНАТА СМЪРТ НА КЛЕТКИТЕ 28 2.1.7 СИГНАЛНИ ПЪТИЩИ НА АПОТОТИЧНАТА КЛЕТИЧНА СМЪРТ 31 2.1.8 ИНДУКТОРИ НА АПОТОТИЧНАТА СМЪРТ КЛЕТКА 4 ​​2.1.9 МЕТОДИ ЗА ОТКРИВАНЕ НА КЛЕТИНАТА СМЪРТ 43 2.2 НУКЛЕОЗОМИ 57 2.2.1 СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ НА ЦУКАТА 2.2.3 КРЪГОВЕ НА ЯДРЕНИ КИСЕЛИНИ В ПЛАЗМАТА И СЕРУМА 68 3 МЕТОДОЛОГИЧЕСКИ ФОН НА ИЗПИТВАНЕТО НА НУКЛЕОЗОМЕНТА 8 3.1 ИМУНХИМИЧНИ МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ И ИЗМЕРВАНЕ 8 3.2 МЕТОДИЧНА ОСНОВА НА ИНИЦИАЛНИЯ ТЕСТ 82 3.3 МОДИФИКАЦИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПАЦИЕНТИ 92 4.1.1 ЗДРАВИ ЛИЦА 92 4.1.2 ПАЦИЕНТИ С БОЛЕСТНИ БОЛЕСТИ 92 4.1.3 ПАЦИЕНТИ С МАЛИГНАЛНИ БОЛЕСТИ 94 4.2 СТАТИСТИЧЕСКИ МЕТОДИ 97 4.2.1 ОЦЕНКА НА КЛИНИЧНО-ДИАГНОСТИЧНОТО КАЧЕСТВО 97 4.2.2 СТАТИСТИЧЕСКИ ПРОЦЕДУРИ В КРОССЕКТОРНИТЕ ИЗПИТВАНИЯ 12 4.2.3 СТАТИСТИЧЕСКИ ПРОЦЕДУРИ

3 1. Различни ли са концентрациите на спонтанните нуклеозоми при здрави хора, пациенти с доброкачествени заболявания и пациенти със злокачествени тумори? Възможно ли е да се диагностицират злокачествени заболявания? 2. Различават ли се спонтанните нуклеозомни концентрации при различните видове тумори? 3. Различават ли се спонтанните нуклеозомни концентрации по отношение на туморните характеристики като стадий, степенуване или хистология? 4. Какви промени в концентрацията на нуклеозомите са резултат от операции, инфекции и последователна антибиоза, както и по време на химиотерапия и радиотерапевтично лечение? 5. При хора със злокачествени заболявания свързаните с химиотерапията и лъчетерапията промени в концентрацията на нуклеозоми корелират с клиничния отговор на терапията и резултатите от образната диагностика? Може ли терапевтично наблюдение да се извършва с помощта на нуклеозоми? Колко безопасно и колко рано може да се оцени ефективността на терапията? 6. Концентрациите на нуклеозомите по време на химиотерапия и лъчетерапия корелират ли с други онкологични биомаркери, използвани за контрол на ефективността на терапията? Възможна ли е сравнима или по-надеждна оценка на успеха на терапията при използване на нуклеозоми?

6 В началото на 60-те години R Lockshin и C Williams използват модела на насекомите за изследване на процеси по време на клетъчна смърт и създават термина програмирана клетъчна смърт като пространствено и във времето предвидим процес (Lockshin 1964). Малко по-късно Тата и Локшин показаха, че тази клетъчна смърт изисква синтеза на макромолекули. Те успяха ефективно да го предотвратят с РНК и протеинови инхибитори (Tata 1966; Lockshin 1969). И накрая, през 1971 г. Джон Ф. Кер описва така наречената свиваща некроза, последователност от промени, които той наблюдава в отделни, умиращи клетки на черния дроб, които впоследствие стават атрофирани, след запушване на порталната вена на плъхове (Kerr 1971). Джон Ф. Кер Андрю Уили сър Alastair Currie Година по-късно, заедно с Andrew Wyllie и сър Alastair Currie, той въвежда термина апоптоза, термин, взет от гръцки, който обозначава падането на листата през есента, и обявява нова ера на модерността Изследване на клетъчната смърт (Kerr 1972). Фигури 2-4 (Cummings 1997): Първият човек, който описва апоптозата Фигури 5 и 6 (Kerr 1994): Апоптотични клетки с типични морфологични характеристики

9 Фигура 8: Хронология на изследванията на клетъчната смърт

1 2.1.2 Дихотомичен модел на клетъчна смърт По исторически причини, след като Кер въведе термина апоптоза, първоначално беше направено разграничение между видовете клетъчна смърт, които са резултат от външни и вътрешни стимули. Клетъчното самоубийство е разделено на най-малко три вида: исхемична клетъчна смърт, свободна радикална клетъчна смърт и генетично регулирана апоптоза (Majno 1995). Както е предложено от Gräper, последният е аналог на митозата. Първоначално под некроза се разбираше макроскопски остатъци от мъртва тъкан. На клетъчно ниво некрозата се нарича пасивна клетъчна смърт, причинена от външни дразнители, за разлика от вътрешната, активно извършваща се разграждане на клетките, апоптоза. Тези две форми бяха приложени по дихотомен начин за всички явления на клетъчната смърт; други форми на клетъчна смърт бяха пренебрегнати до голяма степен (Wyllie 198a; Kerr 1994). Фигура 9: Класически модел на клетъчна смърт (модифициран от Majno 1995): кондензация на хроматиновата руптура на клетъчното ядро ​​непокътната плазмена мембрана апоптоза дехидратация и свиване на клетъчните апоптотични тела подуване на клетката и митохондрии руптура на некрозата на плазмената мембрана

2.1.5 Клетъчна смърт при патологични процеси Клетъчната смърт и клетъчната пролиферация са в добре регулиран баланс в организма, както и в отделните органи и функционални системи. Ако този баланс бъде нарушен, болестите могат да се развият на всички нива: Хомеостаза Клетъчна смърт Пролиферация Преобладаването на скоростта на разпространение над клетъчната смърт може да доведе до локални и системни злокачествени заболявания, както и до метаболитни, възпалителни и някои автоимунни заболявания. Хиперпролиферативни заболявания Клетъчна смърт Пролиферация Прекомерната клетъчна смърт, от друга страна, е основата за развитието на голям брой дегенеративни, хематологични, автоимунни, свързани с исхемия, медиирани от токсини и възпалителни заболявания. Дегенеративни и деструктивни заболявания Пролиферация Клетъчна смърт Преглед на значението на клетъчната смърт при различни заболявания е съставен в следната таблица (Thompson 1995; Fadeel 1999; Robertson 22):

36 Регулирането на сигналните пътища За инициирането и изпълнението на медиирана от рецептора апоптоза са идентифицирани някои централни пътища на предаване на сигнала, които са общи за всички клетки, и са описани някои променливи участъци, различни в зависимост от типа на клетката и задействащия агент. Общите фактори включват образуването на DISC от тримеризирани рецептори, FADD и инициатора прокаспаза 8, както и крайния сегмент на ефекторните каспази, по-специално каспаза 3, което води до активиране на клетъчната структура и разцепващите ядро ​​протеази. Между тях има три променливи секции: 1. директното активиране на каспазната каскада 2. включването на митохондриите с освобождаването на цитохром С 3. активирането на митохондриите и освобождаването на AIF според пътя, който можете да предприемете за извършване на апоптоза могат да се разграничат два типа клетки (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R Фигура 18: Апоптотични сигнални пътища в клетки I и тип II (модифицирани от Krammer 2a) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Субстрати за смърт ТИП I Апоптоза ТИП II

39 Многобройни инхибитори на ефекторни каспази са групирани заедно като IAP (инхибитори на апоптозата). В човешките клетки те включват XIAP (MIHA), c-iap-1 (MIHB), c-iap-2 (MIHC), NAIP и сурвивин. Те започват от активираните каспази 3 и 7 и от апоптозомата и се различават значително по своята инхибираща сила. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Тяхното значение се крие вероятно в фината регулация на сигнала за апоптоза. Това се подкрепя и от освобождаването на допълнителни IAP-регулиращи протеини като Smac (втори активатор на каспази, получен от митохондрии) и DIABLO (директен IAP-свързващ протеин с ниско pi) (Hengartner 2) по време на апоптоза. Най-важните компоненти на сигналните пътища на апоптоза, включително инхибиторните изходни точки, са илюстрирани по-долу: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 ДНК увреждане p53 Фигура 19: Преглед на регулирането на сигналните пътища при апоптоза (модифициран според Hengartner 2 и Rosell 22) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 цитохром c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 APAF-1 апоптозома CASP-3 IAPs Smac/DIABLO AIF субстрати за смърт апоптоза

62 Спирално усукване на ДНК суперхелика в нуклеозомата, което след разхлабване на контактите хистон-ДНК се разгъва и измества хистоновия комплекс (Widom 1997; Kornberg 1999). За функцията на някои от тези комплекси, например за нуклеозомния ремоделиращ фактор NURF, се изисква участието на ацетилирани хистонови краища. Преглед на хроматиновите ремоделиращи комплекси е даден в следната таблица (Kornberg 1999): Промотор P mrna k 12 P нуклеозома k 21 P ДНК усукване и излагане на ДНК Прогресия на транскрипцията P пълен транскрипт Фигура 26: Ремоделиране на хроматин чрез комплекси ISWI (Widom 1997) Таблица 8: Групиране и характеристики на комплектите за ремоделиране на хроматин Хроматин комплекс за ремоделиране Организъм ATPase Молекулно тегло (MDa) Субединици SWI/SNF семейство SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Brahma D. melanogaster Brahma 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 ISWI семейство I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2