Неинвазивно изобразяване на дисеминирана кандидоза при протоколи от ларви на зебра (преведено на френски)
Обобщение
Бързото развитие, малкият размер и прозрачността на зебрата са от голяма полза за изследването на вродения имунен контрол на инфекцията 1-4. Тук ние демонстрираме техники за заразяване на ларви на зебра с помощта на гъбичния патоген Candida albicans Чрез микроинжектиране, използваната наскоро методология за включване на фагоцитна NADPH оксидазна активност в контрола на гъбичния диморфизъм 5 .
Резюме
Дисеминираната кандидоза, причинена от патогена Candida albicans, е клинично важен проблем при хоспитализираните лица и е свързана с 30-40% приписвана смъртност 6. Системната кандидоза обикновено се контролира от вродения имунитет, а хората с генетични аномалии в вродените имунни клетъчни компоненти като тъй като фагоцитната NADPH оксидаза са по-податливи на кандидемия 7-9. Много малко се знае за динамиката на взаимодействието на C. albicans с вродени имунни клетки in vivo. Обширни проучвания in vitro установяват, че извън гостоприемника C. albicans покълва вътре в макрофаги и бързо се унищожава от неутрофили 10-14. Проучванията in vitro, макар и полезни, не могат да обобщят комплекса в среда in vivo, което включва с течение на времето динамиката на нивата на цитокини, прикрепянето на извънклетъчния матрикс и междуклетъчните контакти 10, 15-18. За да се изследва приноса на тези фактори във взаимодействието гостоприемник-патоген, е от съществено значение да се намери моделен организъм, който да визуализира тези аспекти на инфекцията неинвазивно в непокътнат жив гостоприемник.
Ларвата на зебра осигурява уникален и универсален гръбначен гостоприемник за изследване на инфекцията. През първите 30 дни от развитието на ларвите на зебра имат само вродена имунна защита 2, 19-21, което улеснява изследването на заболявания като дисеминирана кандидоза, които са силно зависими от вродения имунитет. Малкият размер и прозрачността на ларвите на данио позволяват да се изобрази динамиката на инфекцията на клетъчно ниво както за гостоприемника, така и за патогена. Флуоресцентните трансгенни ларви с вродени имунни клетки могат да се използват за идентифициране на специфични видове клетки, участващи в инфекция 22-24. Модифицираните антисенс олигонуклеотиди (морфолинози) могат да се използват за унищожаване на различни имунни компоненти като фагоцитна NADPH оксидаза и за изследване на промени в отговор на гъбична инфекция в 5 литра. В допълнение към етичните и практическите ползи от използването на малък по-нисък гръбначен, ларвите на зебра предлага уникалната възможност за изображение на разгърнатата битка между патогени и гостоприемник както интравитално, така и в цвят.
Zebrafish са били използвани за моделиране на инфекция за редица бактерии, патогенни за хората, и са изиграли голяма роля в нашето разбиране за микобактериална инфекция 3, 25. Въпреки това, това е наскоро, когато много по-големи патогени като гъбички са били използвани за заразяване ларва 5, 23, 26 и до момента не е имало подробно визуално описание на методологията за заразяване. Тук представяме нашите техники за микроинжектиране на ромбенцефални вентрикули на първични зебри, включително нашите модификации на предишни протоколи. Нашите резултати, използващи модела на ларвите на зебра за гъбична инфекция, се различават от in vitro проучванията и засилват необходимостта от изследване на взаимодействието между гостоприемника и патогенезата в сложната среда на гостоприемника, а не опростената система на чашата на Петри 5.
Протокол
Всички протоколи и експерименти за грижи за данио са извършени съгласно протокола A2009-11-01 на Комитета за грижи за животните и институционална употреба (IACUC).
1. Морфолинови и ларвени инжекционни ястия
Експериментална продължителност: * (10-15 минути)
Степен на трудност: *
- За инжекции с яйца пригответе 2% разтвор на агароза в стерилна вода и микровълнова фурна. Когато разтворът се охлади, изсипете част от него в изключително дълбока чаша на Петри (Fisher Scientific), докато не се напълни наполовина. Оставете да се охлади върху лед и се уверете, че скарата е изравнена.
- След като съдът се охлади, изсипете 15 ml най-горния слой 2% агароза. Напръскайте набраздена пластмасова инжекционна форма за яйца (Adaptive Science Tools) със стерилна вода от спрей бутилка. Внимателно поставете набраздената страна надолу в горещата агарозна форма. Когато агарът се охлади, използвайте плоска метална шпатула (VWR Scientific), за да отделите формата от увеличения агар. Бавно отстранете решетката от агарозата. Плочи за инжектиране на ембрион в парафилм (VWR Scientific) и инвертирани магазини при 4 ° C.
- За инжекции с ларви, пригответе 2% разтвор на агароза, както е описано. Изсипете разтвора в чаша на Петри със стандартен размер (VWR Scientific) и оставете настрана, докато се втвърди. Увийте съдовете за инжектиране на ларви в Парафилм и обърнете съхранявайте при 4 ° C.
2. Подготовка за отглеждане на гъби
Експериментална продължителност: ** (30 минути)
Степен на трудност: **
3. Инфекции на данио
Експериментална продължителност: **** (1-3 часа)
Степен на трудност: ****
4. Подготовка на рибата за изобразяване
Експериментална продължителност: ** (30 минути)
Степен на трудност: **
- Пригответе разтвора на трикаин метан сулфонат както преди (200 pg/mL). Извадете заразените риби и ги прехвърлете в трикаин.
- Пригответе 47,9 ml 0,4% агароза с ниска точка на топене (Scientific VWR) в яйчена вода. Загрейте разтвора с микровълнова фурна. Охлажда се до 37 ° С и към сместа се добавя метан сулфонат трикаин (200 pg/ml)
- След като рибите са обездвижени в метан трикаин сулфонат, пипетирайте всяка риба в чаша на Петри (VWR Scientific), съдържаща 0,4% агароза с ниска точка на топене (VWR Scientific).
- След това преместете рибата агароза с ниска точка на топене в отделни ямки на стъклен дънен съд (MatTek Corporation) за изображения. Използвайте възможно най-малко агароза възможно най-ниско, за да се стопи, така че рибата да е равна на дъното на купата. Не използвайте достатъчно трикаин-агароза, за да запълните кръговете на TNS в стъклената дънна плоча.