Микроскопски методи
Извършване на постоянни препарати (допълнителен материал - за информация и за справка)
1. Фиксиране. Фиксирането е запазване на материала в състояние, близко до естественото. Това изисква бързо умъртвяване на тъканта, което се постига най-добре с малки парченца жив материал. Веществото, използвано за това, се нарича фиксатор. Бързото фиксиране постига запазване на оригиналната структура на обекта и тъканите се уплътняват толкова много, че от тях могат да се приготвят тънки срезове.
2 дехидратация.Дехидратацията се извършва при подготовка на материала за изливане или за затварянето му в подходяща среда (виж по-долу), която не се смесва с вода. Водата също трябва да бъде отстранена, защото в противен случай лекарството в крайна сметка ще бъде унищожено от бактерии. За за да се запази ултраструктурата, дехидратацията трябва да се извършва постепенно, като материалът се обработва с поредица от водни разтвори на етанол или ацетон с постоянно нарастваща концентрация и завършва обработката с "абсолютен" (безводен) етанол или пропаноп.
3 просветление. Някои от често използваните наливни и покриващи среди не се смесват с алкохол. Следователно тя трябва постепенно да се замени със среда (антирефлексно средство), с която се смесва пълнещата среда, например ксилол. Това също кара материала да стане прозрачен.
4. Попълване. За да се получи много тънък участък с помощта на микротом, е необходимо материалът да се излее в подходяща носителна среда. Когато се подготвят препарати за светлинна микроскопия, предметите се влагат в парафин, който след това се оставя да се охлади. За електронна микроскопия е необходимо да се използват по-твърди вещества (пластмаси или смоли), тъй като тук са необходими особено тънки участъци, което означава, че опората трябва да е по-плътна.
5 правене на филийки. Обикновено парчетата материал са твърде дебели, за да могат да преминат достатъчно светлина през тях за изследване под микроскоп. Обикновено е необходимо да се отреже много тънък слой от тестовия материал, тоест да се подготвят секциите. Разрезите могат да бъдат направени със скалпел, самобръсначка или микротом. Разфасовките се приготвят ръчно с помощта на заточена самобръсначка. За да работите върху конвенционален микроскоп, секциите трябва да са с дебелина 8-12 микрона. Тъканта е закрепена между две парчета сърцевина от бъз. Възможно е да се използват филийки плътни моркови. Самобръсначката се навлажнява с течността, в която се е съхранявала тъканта; прави се разрез през бъз (морков) и кърпа, а самобръсначката се държи хоризонтално и се придвижва към вас с бавно плъзгащо движение, насочено леко наклонено. След като бързо направихте няколко секции, трябва да изберете най-тънкия, съдържащ характерни тъканни области.
Разрез от тъкан, вградена в определена среда, може да се направи с помощта на микротом. За лек микроскоп, парчета с дебелина няколко микрометра могат да бъдат направени с вградена в парафин тъкан с помощта на специален стоманен нож. На ултратом за електронен микроскоп се правят изключително тънки срезове (20-100 nm). В този случай е необходим диамантен или стъклен нож.
6. Боядисване. По правило биологичните структури на препаратите са прозрачни; следователно, за да се получи контраст между тях, трябва да се прибегне до различни средства. Най-често срещаното е оцветяването. Някои багрила, използвани при светлинна микроскопия, са изброени в таблицата по-долу.
Някои багрила в ниски концентрации не са токсични за живите тъкани и поради това могат да се използват за оцветяване на жив материал. Те се наричат жизненоважни (жизненоважни) багрила. Те включват например метиленово синьо и неутрално червено.
Когато се оцветяват парафиновите секции, парафинът се отстранява с разтворител и участъкът се напоява частично.
7. Заключение. Напълно оцветените секции са затворени на предметно стъкло в специална среда, например в канадски балсам или еупарол. Тази среда не позволява на въздуха да премине, така че разрезът да може да се съхранява в нея за неопределено време. Покрийте филийката в средата с фиш за покритие.
Последователността на стъпките, описана по-горе, е типична, когато става въпрос за подготовка на тънки филийки за постоянни препарати. Въпреки това, в процедурата често се правят следните две промени:
а) ако разрезът на суровината се приготвя ръчно, тогава разрезът първо се прави и след това се фиксира;
б) възможно е оцветяване след фиксиране или в процес на дехидратация на всеки етап. Например, багрило, разтворено в 50% етанол, може да се използва за оцветяване на участък, след като е дехидратирано в 50% етанол.
Описаната процедура за приготвяне по същество е еднаква както за светлинния, така и за електронния микроскоп, въпреки че има някои разлики в детайлите (те са изброени в таблицата).
Временни наркотици
Временните препарати за светлинен микроскоп, за разлика от постоянните, могат да бъдат направени относително бързо. Те са подходящи за бързо предварително проучване. Материалът за това е фиксиран, боядисан и затворен в определена среда. Резените могат да се приготвят преди фиксиране или мацерация (дървото например се мацерира).
