Матрични металопротеинази и техните инхибитори в хода на експерименталната хронична болест

1 Матрични металопротеинази и техните инхибитори в хода на експерименталния хроничен панкреатит.

металопротеинази

2 Матрични металопротеинази и техните инхибитори в хода на експерименталния хроничен панкреатит. урна: nbn: de: gbv: 28-дисс

4 1 Въведение и разпит Въведение Извличане на материал Болести на панкреаса Остър панкреатит Хроничен панкреатит Животни модели на панкреатит Модели на остър панкреатит Церулеин панкреатит Диета с ниско съдържание на холин, етионин-съдържаща диета Модел на трипсин Оперативна обструкция на дванадесетопръстника Модели на хроничен панкреатит Оперативна обструкция на дуоденалната киселина от трансформиращ растежен фактор - в панкреаса при свръхекспресия на трансгенна мишка - трансформация на фактор на растеж - в панкреаса при трансгенна мишка Трансгенна мишка с доминантно-отрицателен мутант на TGF тип II рецептор Панкреас brose индуциран от тринитробензен сулфонова киселина (TNBS) Дибутилтин дихлорид Панкреатични звездни клетки Матрични металопротеинази и тъканни инхибитори на матрични металопротеинази Фиброза, панкреатични звездни клетки и матрични металопротеинази 16 2 Материал и методи Материал Химикали ДНК Олигонуклеотиди Буфери и разтвори Бактериална култура Медии Комплекти Лабораторни животни Консумативи Индукция на хроничен DBTC панкреатит 21 1

5 2.3 Екстракция на РНК от панкреаса Откриване на фрагмент за контрол на експресията на мрна Плазмидна ДНК амплификация на бактерии Количествено определяне на нуклеинови киселини РНК електрофореза Обратна транскриптаза Конкурентна полимераза Верижна реакция Електрофореза на PCR продуктите и оценка на флуоресценция Подготовка на звездни клетки на панкреаса Зерна на панкреатична клетка Зона на панкреатична стена и подреждане на гел Извършване на електрофореза и оценка на оцветяване с хематоксилин и еозин 32 3 Резултати Хистология на DBTC панкреатит Настройка на cdna с помощта на -актин Експресия на матрични металопротеинази в тъкан Експресия на MMP експресия на MMP-2 и MMP експресия на тъканен инхибитор на матрични металопротеинази в тъкан Експресия на TIMP Експресия на TIMP MMP в звездни клетки на панкреаса Статистика 41 4 Дискусия Ходът на DBTC панкреатит MMP MMP-9 от левкоцити Връзка между базалната мембрана и MMP синтеза на MMP-9 в PSC РНК експресии на MMP-9 при хроничен DBTC панкреатит Експресия на РНК на MMP-2, MMP-3, TIMP-1 и TIMP-2 при хроничен DBTC панкреатит Заключения 47 2

6 5 Дисертации 48 6 Списък на съкращенията 51 7 Литература 52 8 Благодарности 66 9 Декларация за независимост 67 3

16 Фигура 1: Клетъчни функции под въздействието на протеолитично активни MMP. (А) Деградация на ЕСМ и миграция на клетки. (Б) индукция на пролиферация или апоптоза. (C) Модулация на медиатори и техните рецептори. (D) Активиране на допълнителни протеази чрез разцепване на техните ензими или техния инхибитор (Vu and Werb, 2000). 3 Матричните металопротеинази са група от над 20 известни цинк-зависими протеази. Те са способни да разграждат основните компоненти на извънклетъчния матрикс, като колаген, ламинин, фибронектин или еластин. Поради своята структура от различни домейни, ММР могат да бъдат разделени на четири групи: матрилизин, ММР с хемопексиноподобни домейни, ММР с трансмембранни домейни, ММР с фибронектиноподобни домейни. Всички ММР имат регион, необходим за секреция, са в латентно състояние и имат каталитичен регион, който съдържа активното място на свързване на цинк. 53 Класификацията на MMP обаче се основава на разделяне на семейства, обобщаващи субстратите на MMP (табл. 1)

18 Това се отнася и за про-ензимите. Припокриването на специфичността се обяснява с 50% хомология на последователността на TIMP-1 и TIMP-2. 58,61 Получената ММР активност зависи от съотношението на ММР и TIMP в тъканта. Промените в това равновесие водят или до значително повишена активност на протеолизата на MMPs 59, или до повишена фиброгенеза. 60 Име TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Функция инхибира Pro-MMP-9 и други активни MMPs Инхибира Pro-MMP-2 и активен MMP-2 Не е определено Не е определено Таблица 2: Инхибитори на тъкани на матрични металопротеинази ( TIMPs) и техните функции Фигура 2: Каскада на активиране на матрични металопротеинази от катепсин и плазмин. Автоматично активиране на Pro MMPs от активни MMP и MT MMP 1. Инхибиране на разбиването на матрицата от TIMP. (Evans et al. 1999) 61 15

22 TIMP 2 ампликон дължина: 453 bp TIMP 2 антисенс CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA дължина: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA дължина 23 bp вектори pqr2 и pqr3 от Graham M.A. Wells, Neures Limited, UK Буфери и разтвори Comassie Blue разтвор DBTC разтвор DEPC- H 2 O 1 част ледена оцетна киселина (50 ml) 3 части изопропанол (150 ml) 6 части H2O (300 ml) Добавете 0,25 g Comassie Blue към 100 ml (1,25 g) . DBTC се разтваря с 96% етанол на две части. След това се смесва с три части глицерол. Инкубирайте 1 L dh 2 O с 1% DEPC за една нощ. След това деактивирайте DEPC чрез автоклавиране. Еозин 2,5 g Еозин (Цветен индекс №) 500 ml H 2 O HBSS + FCS Mayers Хематоксилин PBS (фосфатен буфер физиологичен разтвор) полиакриламиден буфер за електрофореза 50 ml HBSS и 15 ml FCS 4%, поставете върху лед. Следното се разтваря в 750 ml вода: 50 g алуминиев сулфат (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1 g хематоксилин (цветен индекс №) 0,1 g натриев йодит (NaIO 3) 1,0 g лимонена киселина 50 g хлорохидрат Ad H 2 O до 1000 ml 120 mM NaCl 170 mm NaH 2 PO 4 3 mm KCl 26 mm KH 2 PO 4, ph 7.2 3.03g (0.025M) Tris 14.1g (0.152M) глицин 1.0g (0.1%) SDS до 1000ml, пълни с H2O. Буфер P1, Qiagen 50mM Tris ph mM EDTA Rnase A (400μg/ml) Буфер P2, Qiagen 200mM NaOH 1% SDS буфер P3, Qiagen 2.55M KAc ph 4.8 Буфер QBT, Qiagen 750mM NaCl 50mM MOPS 15% етанол ph

23 буфер QC, Qiagen буфер QF, Qiagen Stop Solution Буфер за субстрат TAE буфер 1L 1M NaCl 50mM MOPS 15% етанол Ph M NaCl 50mM MOPS 15% етанол ph mg Orange G 2,5g Ficoll 400 EDTA 0,5M 50mmol/l Tris ph8 + 5 mmol/l CaCl2 242 g Трис 57 ml оцетна киселина 96% 100 ml EDTA 0,5M ph8 до 1000 ml H 2 O двойно разст. Трис буфер Tris-HCl 1 M в DEPC-H 2 O, рН 7,4 Triton разтвор 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H 2 O Бактериална културна среда Щам Escherichia coli DH5 от Gibco BRL (Eggenstein, Германия) беше използван като бактериален щам. Културни среди за бактериален растеж са получени от Difco Laboratories, Детройт, САЩ. Ampicillin LB agar plate Добавете 100 mg/l ампицилин към LB agar plate. LB плочи от агар Luria Bertani (LB) - среден 5g екстракт от дрожди 10g триптичен пептон 10g NaCl aqua dest. 15 g агар H 2 O преразпределете до 1 l 5 g екстракт от мая 10 g триптичен пептон 10 g NaCl aqua dest. Регулирайте до рН 7.4 H 2 O, преработете с 1 N NaOH. до 1 l трансформационен буфер 10% (тегло/обем) полиетилен гликол mM MgCl 2 в LB-Medium Kits Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden, Германия Qiagen, Hilden 20-ти