Мащабна реконструкция на дефекти с нова хибридна рамка, изработена от поли
субекти
абстрактно
Въведение
Костните дефекти с критичен размер са често срещано клинично заболяване, обикновено причинено от травма, костно заболяване или резекция на тумор 1. Получената костна загуба не може да бъде възстановена физиологично и обикновено се изискват големи количества костна регенерация 2. Костни присадки като автографти и алотрансплантати са широко използвани за костна индукция и увеличаване при големи костни дефекти 3. Тези костни присадки обаче имат някои ограничения, които правят синтетичните заместители на костни присадки привлекателна алтернатива 4, 5 .
Резултати
Характеризиране на PLLA/nHA/CM-AL рамки
Морфология и порьозност на рамката
Морфологичните характеристики на скелета се визуализират чрез светлинна микроскопия и SEM, както е показано на фиг. Анализът на напречното сечение на рамките под светлинна микроскопия показва, че фотографските зони и CH/nHA-AL (кафяво) са равномерно разпределени в рамките (Фигура 1А). В рамките на SEM рамките показват хомогенно свързана пореста структура с диаметър на порите 150–250 μm. Морфологията на скелета е много различна между двете скелета (PLLA/nHA и CM-AL), като CH/nHA-AL е частично вградена в скелета CM-AL (1A).
Свойства на CM-AL рамки, съдържащи различни концентрации на CH/nHA-AL. ( А. ) Морфология на CM-AL (0%), CM-AL (10%) и CM-AL (20%) рамки при светлинна микроскопия (LM) и сканираща електронна микроскопия (SEM); ( Б. ) Порьозност на CM-AL рамки с различно съдържание на CH/nHA-AL; ( ° С. ) Якост на натиск и модул на CM-AL рамки с различно съдържание на CM-AL; ( Д. ) Ин витро тестване за освобождаване на лекарства на CM-AL скелета за период до 25 дни, като се използват скелета CH/nHA-AL и PLLA/nHA/AL като контроли. Черна стрелка показва PLLA/nHA матрицата, докато бяла стрелка показва CH/nHA-AL микросферите. * стр
In-vitro разграждане на CM-AL рамките с различно съдържание на CH/nHA-AL по време на 12-седмичното наблюдение. ( А. ) Морфологични промени в скелета, наблюдавани при SEM; ( Б. ) рН на разграждащата среда на подготвените скелета с увеличаване на времето за инкубация; ( ° С. ) Загуба на маса на скелето по време на периода на демонтиране. Бяла стрелка показва CH/nHA-AL микросфери. * стр
In vitro цитосъвместимост на скелета CM-AL. ( А. ) Клетъчна морфология и адхезия на заешки ASC върху скеле под SEM; ( Б. ) Анализ на цитотоксичността на ASC, оцелели при излугване на скеле, използвайки MTT анализ; ( ° С. ) Алкална фосфатна (ALP) активност на ASCs в течност за излугване на скеле; ( Д. ) Синтезът на минерализираната матрица беше анализиран за отлагане на калций чрез оцветяване с ализариново червено. Бяла стрелка показва CH/nHA-AL микросфери. * p # p
Рентгенов анализ на костната регенерация по различно време след имплантацията. ( А. ) Представителни рентгенови снимки на костната регенерация по различно време. Имаше ново костно образуване в контролната група, но костният дефект не беше възстановен; В групата за автотрансплантация автоложна ортотопична присадка позволи пълно излекуване на дефекти в радиуса по време на 8-седмичното проследяване; В групата на CM-AL (0%) имплантанти, имаше очевидно ново костно образуване на 8-та седмица. Линиите на костните фрактури почти не са наблюдавани, докато не е намерено омрежване на кухините на костния мозък. В имплантираната група CM-AL (10%) костните дефекти бяха излекувани чрез ново костно образуване в продължение на 4 до 8 седмици. ( Б. ) Полуколичественият анализ показа значително ново костно образуване в CM-AL (10%) - имплантирана група в сравнение с CM-AL (0%) - имплантирана група и данните се увеличават с времето. * стр
Хистологичен анализ на костна регенерация и деградация на скелето по различно време след имплантацията. ( А. ) HE оцветяване, показващо малко количество новообразувани трабекули след 2 седмици както в CM-AL (0%), така и в CM-AL (10%) групи. През седмици 4 и 8 бяха представени груби костни трабекули, групирани с ясно видимата съдова структура. Дефектът, изпълнен с влакнеста тъкан, все още се вижда в CM-AL групата (0%), докато е по-малко видим в CM-AL групата (10%). ( Б. ) Количественият анализ показа увеличението на новата костна площ с включените CM-AL и увеличението в дни. Белите стрелки показват областите на ново образуване на кости, докато черните стрелки показват рамката (увеличение: × 40). * стр
Оцветяването на Masson показва постепенно узряване на новообразуваната кост и в двете групи. Новообразуваната кост беше оцветена в синьо (както показва бялата стрелка) на 2-ра седмица, а синята зона постепенно се сви, докато костта узрее на 8-ма седмица, което показва, че остеогенезата е започнала и в двете групи още на 2-та седмица обаче процесът на остеогенеза продължи по-дълго в CM-AL (10%) група, отколкото в CM-AL (0%) група (увеличение: × 40).
дискусия
Тестът за разграждане in vitro показва повишеното разграждане на CM-AL скелета с повишено съдържание на CH/nHA-AL и няма значителна разлика в разграждането между CM-AL скелета (10%) и PLLA/nHA контрол. Вариацията на pH по време на in vitro разграждане на порести CM-AL скелета е по-малка от тази на PLLA/nHA скелета, което показва деградация както на PLLA матрицата, така и на CM. Междувременно коефициентът на загуба на тегло в скелета CM-AL беше значително увеличен, докато механичните свойства бяха значително по-ниски. Тези резултати са в съответствие с предишното проучване, което показва, че загубата на тегло на композитите, базирани на PLLA, се увеличава с увеличената доза CMs и това се дължи на преференциалното разтваряне на хитозановия компонент в композитите 41. Предполага се, че бързото разграждане на внедрените СМ допринася за загубата на тегло на скелета в ранната фаза 37. Като цяло нашите резултати показаха доказателства, че PLLA/nHA скелета с 10% CH/nHA-AL показват преференциални свойства, докато увеличаването на съдържанието на CH/nHA-AL до 20% причинява неблагоприятния ефект. Следователно, PLLA/nHA скелета с 10% CH/nHA-AL бяха използвани в по-нататъшните проучвания.
Това проучване обаче има и някои ограничения. Молибденовата синя колориметрия се използва предимно за определяне на концентрацията на AL на базата на фосфатния анион във вода. Въпреки че методът се оказа възпроизводим, точен и подходящ за определяне на AL 33, 48. Въпреки това, вместо PBS се използва дестилирана вода, която симулира постоянното pH на телесната течност, тъй като голямо количество фосфат от PBS може да попречи на определянето на AL. Следователно, други методи, които могат по-добре да симулират състоянието на телесната течност, могат да бъдат разгледани за определяне на AL в нашата бъдеща работа.
В обобщение беше установено, че AL капсулирани CH/nHA микросфери са успешно включени в PLLA/nHA базирани скелета и е разработена система за доставка, базирана на микросфера за доставка на AL и инженерство на костната тъкан. Скелета CM-AL (10%) показват по-продължително освобождаване на лекарството и сравними механични и разграждащи свойства. Остеогенната диференциация на ASCs също беше подобрена, както се демонстрира от значително повишена активност на ALP и отлагане на калций. Проучванията in vivo показват отлично заздравяване на костите от скелета на CM-AL (10%), сравними с тези на автографти. Следователно резултатите от това проучване предполагат обещаващото приложение на CM-AL (10%) скелета за доставка на лекарства и инженерство на костната тъкан.
материали и методи
Производство на PLLA
PLLA са получени чрез полимеризация на лактида с отваряне на пръстена. Накратко, L-лактидният мономер (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Шанхай, Китай) беше дехидратиран при 140 до 150 ° C за 4 до 5 часа, последван от декомпресионна дехидратация при 2,5 до 8,0 kPa и 170 ° C за 6-8 h. Продуктите се деполимеризират до лактид в присъствието на калаен октоат (0,27 kPa, 37 ° С). Лактидът се пречиства чрез многократна рекристализация, като се използва етилацетат като разтворител. Провежда се полимеризация с отваряне на пръстена, за да се получи PLLA в присъствието на лактид и калаев октоат като инициатор и катализатор (8000: 1). PLLA кополимерът се характеризира с гел проникваща хроматография (GPC) и инфрачервена спектроскопия с трансформация на Фурие, както е описано по-горе 49.
Производство на порести CM-AL рамки
Схематично представяне на производството на скелета PLLA/nHA/CM-AL за костна регенерация в заешки модел с големи сегментни костни дефекти.
Характеризиране на PLLA/nHA/CM-AL рамки
Морфология и свойства на порьозност
Морфологията на скелета PLLA/nHA/CM-AL се визуализира чрез светлинна микроскопия (Olympus U-RFL-T, Токио, Япония) и сканираща електронна микроскопия (SEM, Nova NanoSEM230, USA). Порьозността на скелета се измерва съгласно принципа на Архимед, както беше описано по-рано 51. Накратко, рамките бяха поставени в измервателен цилиндър, който беше напълнен с определено количество етанол (V1). Записват се общият обем след потапяне в скелето (V2) и обемът на етанола, който остава в цилиндъра (V3) след отстраняването на скелето. След това порьозността се определя, като се използва следното уравнение:
Механични свойства
Рамките с дължина 20 ± 0,7 mm и ширина 7 ± 0,5 mm бяха произведени и изсушени във вакуум в продължение на 24 часа. Механичните свойства бяха измерени с помощта на универсална машина за механично изпитване Instron 1121 при стайна температура със скорост на натоварване 1,0 mm/min и механична деформация 2 mm. Модулът на компресия се изчислява, като се използва динамичният модул на тестер за еластичност DTM-II (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, Китай). Три проби бяха тествани за всяка проба.
Доставка на лекарства ин витро
Освобождаването на лекарството in vitro е измерено съгласно предишния ни метод с някои модификации 33. Накратко, всяко скеле се поставя в диализна торба, потопена в дестилирана вода (40 ml) и се разклаща в продължение на 25 дни при 37 ° С и скорост 45 об/мин. Супернатантата (2 ml) се събира всеки ден и се определя количествено чрез колориметричен тест с молибденово синьо.
Разграждане in vitro
Правоъгълни проби от скеле се потапят във фосфатен буферен разтвор (PBS) и се наблюдават чрез изменение на рН и съотношение на загуба на тегло. РН се измерва веднъж седмично в продължение на 16 седмици. Загубата на тегло на скелета се отбелязва на всеки 4 седмици след вакуумно изсушаване по време на периода на демонтиране. Три проби от всяко скеле бяха направени за всяка точка от времето.
Тест за биосъвместимост in vitro
Клетъчна морфология и анализ на адхезията
Скелето се култивира заедно със стволови клетки, получени от заешка мазнина (ASCs, Cyagen Biosciences Inc., Гуанджоу, Китай) за анализ на клетъчната морфология и адхезия. Скелетата бяха нарязани на малки парченца (7 mm x 7 mm x 1 mm) и стерилизирани с помощта на нискотемпературна плазмена стерилизация. ASC (1 × 104 клетки/ml, 100 μl) се посяват върху скелета и се инкубират в продължение на 2 часа в инкубатор при 37 ° С, за да се позволи прикрепването на клетките. След това се добавят 2 ml модифицирана среда на орел (DMEM) на Dulbecco, допълнена с 10% фетален говежди серум, за да се поддържа хидратирана. На 2 и 5 ден от културата, скелета, засяти с клетки, бяха отстранени и внимателно измити три пъти с PBS. След това клетките на скелета бяха имобилизирани с 4% формалдехид и осмиев тетроксид за 15-30 минути при 4 ° С и внимателно измити 3 пъти с PBS. След това пробите бяха дехидратирани последователно с поредица етанол (50, 70, 90, 95 и 100%) два пъти в продължение на 10 минути всеки път. Пробите бяха оставени да изсъхнат в критична точка и покрити със злато за SEM анализ на клетъчната морфология и адхезия.
Тест за цитотоксичност in vitro
Плочите от 100 mg квадратни скелета (14 плаки, 7 mm × 7 mm × 1 mm/плоча) се стерилизират и се потапят в 20 ml среда при 4 ° С за 48 часа. ASC на заек (5 х 104 клетки/ml, 100 ul) се посяват в 96-ямкови плаки и се култивират в инкубатор при 37 ° С в продължение на 48 часа и след това средата се освежава. МТТ разтвор (1 mg/ml, 100 µl, Sigma-Aldrich) се добавя към всяка ямка на 1, 3 и 5 ден и се инкубира в продължение на 4 часа при 37 ° С. След отстраняване на супернатантите, 150. l Добавен диметилсулфоксид (DMSO, Sigma-Aldrich) за разтваряне на кристалите син син формазан. Абсорбцията е измерена при 490 nm с ELISA четец (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, USA).
In vitro остеогенна диференциация
Остеогенният ефект на PLLA/nHA/CM-AL скелета in vitro се анализира чрез анализ на активността на алкална фосфатаза (ALP) и чрез оцветяване с ализариново червено. ASC на заек (5 х 104 клетки/ml, 120 µl/гнездо) бяха засяти в 12-гнездова плака, съдържаща извлечени течности от скелета със или без остеогенна среда (OGM, DMEM, 10% FBS, 100 nmol/l дексаметазон). 0,05 mmol/l аскорбинова киселина и 10 mmol/l & bgr; -Глицерофосфат). Активността на ALP се измерва на 7 и 14 ден, както е описано по-рано 31. За оцветяването с ализариново червено средата се сменя на всеки 3 дни. Клетките бяха получени на 7 и 14 ден и фиксирани в 4% формалдехид за 15 минути. След измиване два пъти с PBS, пробите се обработват с ализариново червено (0,5 ml, 40 mmol/l, pH = 4,1) в продължение на 25 минути. След това изображенията са направени под обърнат оптичен микроскоп (Nikon, Токио, Япония). Процентите на положителните клетки са изчислени от поне 3 произволно избрани полета.
In vivo регенерация на костите
Статистически анализ
Данните бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Експериментите са проведени в три екземпляра. Статистическите сравнения бяха направени чрез t-тест на Student или еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), както е подходящо. Стойностите на Р под 0,05 се считат за статистически значими.
Денят на благодарността
Тази работа беше подкрепена от Националната фондация за природни науки на Китай (грант № 81371934, № 81501860 и № 31470948) и финансирана отчасти от Китайския съвет за стипендии (грант № 201506370173).
Забележки
Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.