Лабораторно списание - Методи - Оптимизирана среда за клетъчна култура
Миря Краузе
Производството на разтворими рекомбинантни протеини в бактериалните клетки не винаги работи гладко. Миря Краузе обяснява как новоразработената система за клетъчни култури En Base може значително да увеличи клетъчната плътност и количеството разтворим протеин на клетка.
По принцип задачата на клетъчните култури, които се използват за експресията на рекомбинантни протеини, е много проста: те трябва да произвеждат разтворими протеини, които са възможно най-активни. С много стандартни протоколи за клетъчна култура обаче това работи само частично или понякога изобщо не. Най-известният протокол за култивиране на клетки от Е. coli в колби за разклащане вероятно е протоколът Sambrook, който е изброен в „Библията за молекулярна биология“ на Том Маниатис. Повече от 20 години молекулярните биолози използват този протокол като ръководство, което често работи - но не винаги.
Протеините, които могат да бъдат изразени само лошо или изобщо да не се използват Sambrook или друг стандартен протокол, обикновено се считат за „трудни кандидати“, които изискват специални трикове. Тези случаи също се случват в нашата работна група и често търсим ленти от експресирания протеин в SDS-PAGE гелове с лупа.
Преядени бактерии
Причината за лошия добив при експресията на протеини в бактериални култури често е явление, което се среща и при хората: бактериите просто преяждат. Средата за разклащане на култури "тече" като правило като партида култури и съдържа всички компоненти и хранителни вещества за по-нататъшно култивиране от първата секунда. Процесът е предимно неконтролиран, което означава, че важни параметри като стойността на рН, количеството разтворен кислород и концентрацията на глюкоза в средата не се контролират.
В резултат на това високата скорост на дишане на бързо растящите бактерии надвишава скоростта на пренос на кислород в културата. Това бързо води до изчерпване на кислорода и по този начин ограничаване на растежа. Сега бактериите растат бавно и намаляват производството на протеини. Те адаптират метаболизма си към условията на анаеробна култура и освобождават метаболити, които понижават стойността на рН. В допълнение, неконтролираното количество глюкоза, присъстващо в стандартните сложни среди води до излишен метаболизъм. Това води до натрупване на допълнителен ацетат, което допълнително понижава стойността на рН на хранителната среда, докато преядените бактерии окончателно „се разболеят“.
Цялото нещо се засилва, когато стряскащите колби - както е обичайно в много лаборатории - се затварят с памучни тапи, алуминиево фолио или метални капачки. Трансферът на кислород в културите пада до нула и преходът към анаеробни, т.е. неблагоприятни условия на култивиране, също се ускорява. Решение за транспортиране на кислород в колбите се предлага от самозалепващи се, стерилни, еднократни запечатващи мембрани, така наречените AirOtop Seals. Мембраните AirOtop не пропускат микроби отвън в културата, а кислород. Описаният по-горе проблем с преяждането все още остава.
За да се поддържат клетките здрави, определено количество глюкоза непрекъснато се изпомпва в реактора във ферментационни реактори в така наречения процес на захранване. В същото време сензорите контролират стойността на рН и съдържанието на кислород. По този начин може да се постигне много висока плътност на клетките и да се увеличи производството на разтворими рекомбинантни протеини.
Но как може да се прехвърли принципът на захранващата партида от биореакторите в разклащащи колби или микротитърни плаки? Съвсем просто: чрез поставяне на бактериите на „захарна диета“.
Средно от Финландия
Преди няколко години групата на Питър Нойбауер от Университета в Оулу във Финландия разработи системата за клетъчни култури EnBase (на базата на ензими на база субстрат), която контролирано освобождава глюкозата в средата чрез ензимно смилане на нишестето (Panula-Perälä et al., Microbial Cell Factories 2008, 7:31). Междувременно инженерът по биопроцес Нойбауер се премести от далечния север в ТУ Берлин и създаде друга среда, наречена EnBase Flo, с екипа си, която съдържа освобождаващи глюкоза полимери в разтворима форма.
Захарна диета
С EnBase Flo количеството глюкоза в средата може да се контролира чрез ензимната концентрация (глюкоамилаза), определена в културата (Krause et al., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). Захарната диета предотвратява вредния излишен метаболизъм в бактериите и гарантира, че стойността на pH остава стабилна за повече от два дни и по този начин значително по-дълго, отколкото при LB среда, в която стойността на pH е постоянна само в продължение на шест до осем часа. Така наречените бустер таблетки допълнително засилват рН-стабилизиращия ефект. По този начин бактериите остават здрави и могат да се култивират при контролирани и стабилни условия, при които постигат значително по-висока плътност на клетките. Освен това добивът на разтворим, активен протеин се увеличава до десет пъти. EnBase Flo Medium, който е подходящ не само за лабораторен мащаб, но и за процеси с висока производителност, вече се предлага и в таблетен формат под името EnPresso, което прави отглеждането още по-лесно.
Следващият кратък протокол илюстрира колко проста е клетъчната култура със системата EnBaseFlo. Необходими са ви: стерилна колба от 500 ml, стерилна вода, антибиотици, индуктор и комплект таблетки за еспресо. Първата стъпка е да се подготви предкултура. Това може да бъде инокулирано от течна култура за една нощ, глицеролова пръчка или от агарова плоча. След това при стерилни условия добавете 50 ml стерилна вода и две средни таблетки към 500 ml колба, изчакайте, докато таблетките се разтворят и след това добавете необходимия антибиотик и 50 µL EnZ’Im (глюкоамилаза). След това предварителната култура се инокулира (OD 600 = 0,05 до 0,15), колбата се затваря с мембраната AirOtop и културата се стартира. След култивиране през нощта (16-20 часа) се добавят бустер таблетка, 50 uL EnZ’Im и индуктор. След това култивирането продължава и клетките се събират след 24 часа.
Последни промени: 23.02.2011