Количествен коефициент на съотношението за анализ на динамиката на

анализ

  • Теми
  • Резюме
  • Въведение
  • Резултати
  • Разработване, оценка и оптимизация на сензори в клетъчна система на бозайници
  • Характеризиране и приложение на пропорционалния ауксинов сензор в растителни клетки
  • Дискусия
  • Методите
  • Плазмидна конструкция
  • Клетъчна култура на бозайници, трансфекция и лечение с ауксин
  • Растителен материал
  • Изолиране на протопласти, трансформация и обработка на ауксин
  • Анализ на трансгенната експресия
  • Индукторите
  • Анализ на луминесценция
  • статистически анализи
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • коментари

Теми

  • В
  • Биологични техники
  • Молекулярно инженерство в растенията
  • Фабрика за сигнализация

Резюме

Количественият анализ на разрешените във времето на ауксин-медиираните процеси в растителните клетки все още е ограничен. Прилагайки синергичен подход към синтетичната биология на бозайници и растения, ние разработихме нов съотносителен биосензор със светлинна светлина, широко приложим за изследване на метаболизма, транспорта и сигнализирането на ауксина. Чувствителността и кинетичните свойства на нашия генетично кодиран биосензор отварят нови перспективи за анализ на изключително сложната динамика на ауксина в растежа и развитието на растенията.

Въведение

За да отговорим на тези изисквания, ние разработихме хемилуминесцентен рациометричен сензор, използващ взаимодействието, опосредствано от ауксин между TIR1 и Aux/IAA. Чрез прилагане на базиран на разграждането сензор в преходна система за клетъчна експресия на гени, например протопласти, се очаква висока времева разделителна способност. В допълнение, луминесцентните репортери осигуряват високи съотношения сигнал/шум и следователно висока чувствителност, както и необходимия широк динамичен диапазон 13, 14. И накрая, извършването на пропорционални количествени оценки допринася за устойчивостта на инструмента, като коригира разликите, специфични за клетките, или променливостта, характерна за преходните анализи 15 .

Резултати

Разработване, оценка и оптимизация на сензори в клетъчна система на бозайници

За да отговори на спецификациите, описани за съотносителен ауксинов сензор, ние проектирахме синтетична конструкция, включваща луцифераза на светулка, слята към зависима от ауксин последователност на разграждане/елемент на Aux/IAA протеини (сензорен модул) и бъбречна луцилаза (нормализиращ елемент) (сензорен дизайн, Фиг. 1а). Двата компонента са свързани с 16 2А пептид, което води до тяхната стехиометрична ко-експресия, като по този начин позволява проследяване на зависимата от ауксин деградация на сензора под формата на намаляване на светлицата срещу луминесценцията на ренила.

Следователно ние се възползвахме от описаните характеристики на Aux/IAA протеини за рационалното проектиране на сензорни модули: i) серия от синтетични сензорни модули са разработени от различни Aux/IAA протеини, за да се получат сензори с различни динамични диапазони на ауксин чувствителност; ii) за да се сведе до минимум потенциалната намеса на сензора с ендогенни ауксинови сигнални компоненти, бяха използвани само 13-те аминокиселинни минимални дегронни последователности на различните Aux/IAA протеини.

Съответно, използвахме като сензорни модули 13-аминокиселинните последователности на три различни Aux/IAA, обхващащи широк спектър от чувствителност, а именно AtIAA17, AtIAA28 и AtIAA31, с афинитети на свързване на ауксин от 33 nM, 75 nM и> 1000. nM, съответно 10. 13-аминокиселинната минимална дегронна последователност на AtIAA17 съвпада с 13-аминокиселинно-чувствителната към ауксин консенсусна последователност от 22 Aux/IAA 18 протеина (QVVGWPPVRSYRK, min17-Luc сензор, Допълнителна таблица 1), докато тези на AtIAA28 и AtIAA31 значително се отклоняват (PVVGWPPVRSSRR и ARQDWPPIKSRLR, генериращи съответно сензорите min28-Luc и min31-Luc, допълнителна таблица 1). Конструкция без сензорен модул служи като отрицателно управление на системата (Ctrl-Luc, конструкция на контрола, допълнителна таблица 1).

(а) Първоначално характеризиране на избрани варианти на сензора в протопластите на А. талиана. 24 часа след трансформацията, протопластите, експресиращи FL-Luc, L2min17-Luc или Ctrl-Luc, се инкубират за 5, 15 или 45 минути в среда без хормони или с ауксинов комплемент (1 μM IAA). Рациометричните луциферазни активности са представени като средни стойности ± sem (n = 6). Показани са статистически значения (двустранен t-тест, * P 10, 23. Забележително е, че освен високата си чувствителност и реактивност, сензорът за консенсусна последователност е в състояние да прави разлика между различни аналози на ауксина, като по този начин разкрива своя потенциал като инструмент за изучаване на метаболизма, транспорта и сигнализирането на физиологично активни съединения.

Дискусия

Количественото наблюдение на ауксина в живите клетки се оказа трудно. Използвайки рациометрична луминесцентна репортерна система, успяхме да разработим биосензор, базиран на разграждане, за едноклетъчни системи, отговарящ на изискванията за висока чувствителност и времева разделителна способност, необходими за проучвания на сложни ауксин-медиирани процеси. За тази цел ние приложихме синергичен подход на синтетична биология, включващ инженеринг и предварителна характеристика на сензора в безхлорна хетероложна клетъчна система на бозайници, последвано от успешното му приложение в растителните клетки.