Колекция от замразени региони на мозъка на гризачи за протокол за анализ надолу по веригата (преведено на френски)

Обобщение

Тази процедура описва събирането на дискретни замразени мозъчни области за получаване на висококачествен протеин и РНК с помощта на евтини и често достъпни инструменти.

Резюме

Тъй като нашето разбиране за невробиологията напредва, често се извършват молекулярни анализи върху малки области на мозъка, като медиалната префронтална кора (MPFC) или ядрото натрупване. Предизвикателството в тази работа е да се направи дисекция на правилната област, като същевременно се запази микросредата, която трябва да се изследва. В тази статия ние описваме прост и евтин метод, използвайки ресурси, лесно достъпни в повечето лаборатории. Този метод запазва нуклеиновата киселина и протеините, като поддържа тъканта замръзнала през целия процес. Мозъците се нарязват на секции от 0,5 до 1,0 mm с помощта на мозъчна матрица и се поставят върху замразена стъклена плоча. Ориентирите във всеки раздел се сравняват с референтна книга, като например мозъчния атлас на Алън Маус, а регионите се дисектират с помощта на студен скалпел или биопсичен удар. След това тъканта се съхранява при -80 ° C до употреба. Чрез този процес mPFC на плъхове и мишки, nucleus accumbens, дорзален и вентрален хипокампус и други региони бяха успешно анализирани с помощта на qRT-PCR и Western тестове. Този метод е ограничен до области на мозъка, които могат да бъдат идентифицирани с ясни ориентири.

Въведение

Тази работа илюстрира дисекцията на замразени мозъчни области за извличане на висококачествени киселинни или нуклеинови киселинни протеини, използвайки справочник, като например Ален мишка на Алън 1, като ориентир. При тази техника мозъците се замразяват и съхраняват при -80oC за последващо секциониране и дисекция, докато се държат в замръзнало състояние. Този процес позволява на изследователя да събере голям брой мозъци за една сесия и да ги дисектира по-късно за точно събиране от множество региони на мозъка.

Точното събиране на мозъчни области от интерес (ROI) често е необходимо, когато отговаряте на въпроси, свързани с експресията на гени и протеини. Докато фармакология, електрофизиология и оптогенетика могат да бъдат използвани при диви или генетично модифицирани гризачи, за да се изяснят молекулярните промени, залегнали в наблюдаваното поведение 2, 3, 4, измерването на промените, индуцирани в транскриптомите и протеомите, често се използва в подкрепа на тези констатации., Техники като количествена обратна полимеразна верижна реакция (RT-qPCR), Western bloat, RNAseq 5, MAPSeq 6 и HPLC 7 са здрави и сравнително ниски на разходите, позволявайки на много лаборатории да "изследват молекулните промени, индуцирани в малки региони на мозък 2, 4, 5, 6 .

Дисекцията на микропунчове върху замразена тъкан не е нова. Ранните статии на Миклош Палковиц и други описват подробно основните техники 14, 15. Тази презентация до голяма степен следва първоначалната работа, с някои подобрения, за да се улесни ефективността и да се намалят разходите за необходимото оборудване. Например мозъчните секции се правят в замразен мозъчен блок, а не в криостат. Това създава по-дебели секции, които намаляват броя на секциите, необходими за събиране на проби от ROI. Този метод също така разчленява проби върху замразена стъклена плоча, която лежи върху сух лед в изолирана кутия. Това създава стъпка за под-замразяване на пейката, върху която да работите. Разделените по този начин раздели лесно се манипулират, което позволява на изследователя да сравнява двете страни на всяка секция с препратка, за да ограничи замърсяването на региони извън желаната възвръщаемост на инвестициите.

Предимствата на този протокол са, че 1) мозъкът се поддържа в замръзнало състояние по време на целия процес, което помага да се запазят протеините и нуклеиновата киселина и дава на изследователя време за внимателно събиране на AI, и 2) необходимите реактиви са евтини и могат да бъдат намерени в повечето лаборатории за молекулярна биология. В този процес цели мозъци се разделят на 0,5-1,0 mm в мозъчна матрица и се поставят върху замразена стъклена плоча, която непрекъснато се охлажда със сух лед. Забележителности, открити в мозъчния атлас на Алън 1 или други мозъчни атласи 16, 17, се използват за идентифициране на интересуващи региони, които след това се дисектират с помощта на студен удар или скалпел. Тъй като тъканите никога не се размразяват, районите, събрани по този начин, осигуряват висококачествена РНК и протеин за последващи анализи.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Животните, използвани в това проучване, са третирани по етичен и хуманен начин, както се съобщава от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) към Университета в Индиана и Националните насоки. Институти по здравеопазване (NIH).

ЗАБЕЛЕЖКА: Всички инструменти и повърхности трябва да се измият с подходящ разтворител, за да се отстранят нуклеази 18, преди да се започне каквато и да е работа.

1. Съхранение на мозъка

  1. Бързо отстранете мозъка от евтаназирани възрастни CD1 мишки от дива хартия с тегло приблизително 30 g, използвайки конвенционален подход 13 и замразете светкавицата за 60 секунди в течен азот или изопентан, предварително охладени със сух лед.
  2. Съхранявайте замразените мозъци при -80 ° C в алуминиево фолио или конични тръби до употреба.

2. Подготовка на мозъчния матрикс

  1. Двадесет и четири часа преди дисекция на тъкан, поставете чиста мозъчна матрица (вж таблица с материали)върху купчина размразени пакети с фризери. Сандвич на страните на матрицата между две фризерни опаковки, като се уверите, че оставя приблизително 0,5 см между дъното на слотовете за бръснач и горната част на опаковките с гел (Фигура 1А). Поставете алуминиево фолио върху краищата, за да улесните охлаждането.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Когато купувате мозъчна матрица, закупете такава, която е достатъчно голяма, за да обхване целия обем на мозъка, който трябва да бъде дисектиран.
  2. Поставете кутията, съдържаща мозъчната матрица и пакетите с фризери, във фризер -20oC с отворено горно за една нощ.

3. Поставяне на замразена стъклена плоча