Кардиомиоцити, получени от стволови клетки след трансплантация на костен мозък и сърце - а
Резюме
Въведение
Общоприето е, че кардиомиоцитите представляват стабилна популация без потенциал за регенерация 1 или с ограничени възможности за регенерация. 2, 3 Следователно, единственият лек за сърдечна недостатъчност в краен стадий е сърдечната трансплантация (HTX).
Предполага се, че регенерацията на миокарда може да настъпи от стволови клетки от различни източници (ембрионални, скелетни миобласти, хематопоетични стволови клетки) и такъв метод дори е предложен като основа за лечение на миокарден инфаркт. 1, 4, 5, 6 Локалното интракардиално инжектиране на (генетично модифицирани) стволови клетки изглежда обещаващо в експериментални проучвания 6, 7, 8, въпреки че терапевтичната приложимост на такъв подход остава несигурна. 9, 10 В някои случаи инжектирането на тези клетки е довело до подобрена хемодинамика без данни за жизнеспособна трансплантация. 11, 12 Броят на човешките изследвания на трансфера на стволови клетки и последващото проследяване все още е ограничен 4, 13, 14, тъй като проследяването на стволови клетки in vivo все още е трудно при хората. 15, 16
Последните проучвания при пациенти след HTX или BMT показват приток, репопулация и диференциация на сърдечни клетки, получени от BM, съответно от сърдечния реципиент или донора на BMT. Въпреки това, броят на нахлуващите стволови клетки, които се диференцират в кардиомиоцити, варира значително в различните експериментални и човешки изследвания. 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Тази хетерогенност вероятно се дължи на надценяване на кардиомиоцитите, получени от гостоприемника, поради наличието на голям брой възпалителни клетки, получени от гостоприемника и/или приложение на различни техники за откриване.
Поради това анализирахме човешката сърдечна тъкан, получена след аутопсия от пациенти, претърпели сърдечна трансплантация или асимптотична сърдечна трансплантация, използвайки същия набор от техники за откриване. Клетките се характеризират с in situ хибридизация за Y хромозомата (женско сърце при мъжки пациент в случай на HTX и мъжка трансплантация на BM при пациент в случай на TMO). За да се разграничат кардиомиоцитите, получени от гостоприемник и донор, от други инфилтриращи клетки (получени от стволови клетки) (ендотелни клетки, възпалителни клетки), in situ хибридизацията на Y хромозомата се комбинира с имунохистохимична характеристика. (IHC) на клетки като левкоцити (CD45), Т-клетки (CD3), макрофаги (CD68), стволови клетки и ендотелни клетки (CD34) и кардиомиоцити (миозин 21). Това се комбинира с 3D лазерна сканираща конфокална микроскопия, за да се присвоят Y-положителните ядра на определен тип клетки. 22.
В това проучване потвърдихме наличието на кардиомиоцити, левкоцити и ендотелни клетки, получени от хематопоетични стволови клетки в миокарда на пациенти след трансплантация на сърце или TSS, получени от BM. Освен това показахме, че броят на кардиомиоцитите, получени от гостоприемника, не се различава значително между пациентите след двата вида трансплантация и е най-много 1%.
материали и методи
Пациентски материал
Инкрустирани с парафин проби от сърдечна тъкан бяха открити от аутопсийния архив на патологичния отдел на Университетския медицински център в Утрехт. Изследван е материал от седем пациенти с BMT, които са получили мъжки трансплантации. Двама пациенти с BMT, съобразени с пола, служеха за контрол. В допълнение, материалът е получен от шест пациенти с HTX от мъжки пол, които са получили женско сърце. Характеристиките на пациента са обобщени в Таблица 1. Като контроли са използвани тъкани от две мъжки сърца и две сърца, получени при аутопсия на пациенти без HTX и сърдечно заболяване. Преди трансплантацията всички пациенти са дали разрешение да използват тъканите си за изследвания. Всички тъкани бяха вградени в парафин и нарязани на участъци с дебелина 6 mm.
Таблица в пълен размер
Флуоресценция in situ хибридизация
За откриване на Y хромозома в парафиновите секции беше използвана сонда SRY 23. Тази сонда е маркирана с дигоксигенин (DIG), като се използва комплект за псевдо превод (Roche, Mannheim, Германия), съгласно инструкциите на производителя. FISH се извършва, както е описано по-рано: 24 кратко депарафинизирани стъкла се усвояват в пепсин (0,11 g пепсин (1:10 000; Sigma, Steinheim, Германия)/100 ml глицин/HCl буфер рН 2, 0) за 10 минути. След дехидратиране на предметните стъкла и изсушаване, се добавят 50 ul маркирана с DIG сонда SRY и предметите се поставят върху котлон при 98 ° С за 10 минути. След инкубация през нощта при 37 ° С, предметните стъкла се изплакват във формамид/SSC2x/50% Tween и 2x SSC/Tween, съответно за 15 и 10 минути. След това предметните стъкла се блокират в 5% обезмасляващ блокиращ реагент в 4 х SSC и се инкубират със 100 µl антитяло, маркирано срещу овчи анти-DIG флуоресцеин изотиоцианат (Roche). След изплакване ядрата се оцветяват с пропидиев йодид. Флуоресценцията на FITC и пропидиев йодид се изследва под стандартен флуоресцентен микроскоп или чрез конфокална лазерна сканираща микроскопия (CLSM) и се отбелязва.
Двойно оцветяване FISH/IHC
Оценка на тъканите
Оцветените разрези на тъканите бяха изследвани със стандартен флуоресцентен микроскоп и с MRC-1000 лазерно сканираща конфокална образна система (Bio-Rad Microscience, Hercules, CA, USA). Слайдовете на сърдечната тъкан бяха заслепени и двама независими изследователи отбелязаха положителни клетки за Y-миозин и Y-CD34. Области, богати на съединителна тъкан и/или области с гъсти лимфоцитни инфилтрати бяха игнорирани. Преброени са общо 1000 сърдечни ядра на предметно стъкло, като се използва 600-кратно увеличение, за да се визуализират най-добре сигналите на хромозомата Y. Използвани са строги критерии за определяне на клетките на сърдечния мускул. Ядрата трябваше да бъдат напълно заобиколени от миозин и освен това бяха изключени влакна, съдържащи повече от едно ядро. В същото микроскопично поле се отчита и общият брой на Y хромозомно положителни клетки, различни от кардиомиоцитите. Ефективността на Y хромозомната сонда се определя чрез преброяване както на общия брой ядра в мъжкото контролно сърце, така и на броя на тези ядра, съдържащи Y сигнала.
статистически анализи
За статистически анализ беше извършен t тест на Student с помощта на софтуер Prism. Данните са изразени като средна стойност и стойност на P. Стойностите на P, по-малки от 0,05, се считат за значими.
Резултати
Y хромозомни положителни кардиомиоцити
Y хромозомни положителни клетки, открити в различни контролни тъкани. ( в ) Наличието на положителни клетки за Y хромозомата в мъжката сливица. Обърнете внимание на разликата в процента на положителните клетки в епитела (70–80%) и лимфоидната тъкан (> 95%; × 200). ( б ) Положително мъжко контролно сърце. В кардиомиоцитите сигналът за Y хромозома е открит в 45,9% от клетките (х 200). ( срещу ) Не се наблюдава положителен сигнал за Y хромозома в нормалната женска сърдечна тъкан (× 200). ( д ) Трансплантиран (женски) сърдечен миокард с редица инфилтрирани мононуклеарни клетки (мъж реципиент), всички от които изразяват положителен Y сигнал (× 400).