Инжектиране на инсулин и екстракция на хемолимфа за измерване на инсулиновата чувствителност при възрастни дрозофили

Обобщение

Запазените пътища за инсулинова сигнализация, открити в плодовата муха Drosophila melanogaster, правят този организъм потенциален инструмент за моделиране на метаболитни нарушения, особено диабет тип II. За тази цел е от съществено значение да се установят физиологични анализи за ефективно измерване на инсулина със системно действие при елиминирането на периферната глюкоза при възрастната муха.

Резюме

Протокол

1. Приготвяне на инсулиновия разтвор

  1. Пригответе нов разтвор на говежди инсулин чрез разтваряне на инсулина в PBS, за да се получи концентрацията от 0,01 mg/ml. Инсулин/PBS и контролните PBS разтвори трябва да се държат върху лед по време на инжекционната процедура. Тези разтвори трябва да се приготвят с 0,5% (v/v) син FD&C №. 1 хранителен оцветител.

2. Подготовка на игли и настройка за инжектиране

3. Подготовка за мухи

  1. Десетдневни женски мухи се използват за инжекционни експерименти. Съберете мухите в рамките на 24 часа след излюпването. Анестезирайте мухите с навлажнен CO 2 върху газова подложка, сортирайте мъжките и поставете женските мухи във флакони, съдържащи стандартен или режим на лечение. Поддържайте женските мухи на експериментални диети в продължение на 10 дни.
  2. На десетия ден след излюпването и разделянето на експерименталните диети прехвърлете мухите от флаконите, съдържащи храната им, във флакони, съдържащи 5 ml 2% агарна запушалка и ги гладувайте за 12-16 часа.
  3. Прехвърлете гладните мухи във флакони, съдържащи 10% глюкозни филтри, за да киснат за 1 час преди инжектиране на инсулин.
  4. Накратко обезболете мухите с навлажнен CO 2 след глюкозното хранене, след което ги обездвижете на студено върху лед.

4. Инжекционна процедура

5. Събиране на хемолимфа

6. Определяне на хемолимфната глюкоза

  1. Изхвърлете проби от хемолимфа в микроплаки, съдържащи 100 µl Infinity глюкозен реагент. Дръжте чинията на лед, докато зареждате проби от хемолимфа.
  2. Установете стандартна крива чрез отделно зареждане на 1 µl от 50 mM, 25 mm, 12.5 mm, 6.25 mm и 3.125 mM глюкозни разтвори.
  3. Инкубирайте проби при 37 ° С за 10 минути.
  4. Открийте абсорбцията при 340 nm.
  5. Пребройте обема на събраната хемолимфа и определете концентрацията на глюкоза в пробата въз основа на стандартната крива с известни концентрации на глюкоза.

7. Представителни резултати

Типичен инсулино-толерантен отговор се открива при инжектираните инсулинови мухи, където се установява спад в нивата на циркулиращата глюкоза 15 минути след инжектирането. За разлика от това, такъв отговор не се наблюдава при инжектирани с PBS мухи (фиг. 3). Този периферен отговор на елиминиране на глюкозата продължава от инжектирания мухи инсулин до 30 минути след инжектирането. Редовно извличаме 0,2-0,5 л хемолимфа на 4-5 мухи във всяка инжекционна група. Във всеки експеримент са включени три инжекционни групи.