Инхибирането на коннексиновите хемиканали облекчава безалкохолния стеатохепатит при мишки
субекти
абстрактно
Въведение
Безалкохолното мастно чернодробно заболяване (NAFLD) е най-често срещаното хронично чернодробно заболяване с приблизително разпространение от 25% в световен мащаб 1. NAFLD представлява спектър от заболявания, вариращи от чернодробна стеатоза до безалкохолен стеатохепатит (NASH), чернодробна фиброза, чернодробна цироза и накрая хепатоцелуларен карцином 2. Чернодробната стеатоза може да бъде причинена от повишен приток на мастни киселини от диета с високо съдържание на мазнини, инсулинова резистентност, лекарства и генетични фактори. Като такава, стеатозата се характеризира с натрупване на липидни капчици на базата на триглицериди в цитозола на хепатоцитите 3. Чернодробната стеатоза може да се развие в NASH в отговор на редица тригери като възпалителни цитокини, адипокини, реактивни кислородни видове и стрес от ендоплазмен ретикулум 4 .
Резултати
Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 върху активността на кръстовището и реакциите на хемиканален коннексин
TAT-Gap24 и TAT-Gap19 имитират аминокиселинна последователност в областта на вътреклетъчната верига на Cx32 и Cx43, съответно. Установено е, че Gap19 се свързва със С-терминалния регион на Cx43, като по този начин прекъсва взаимодействието между вътреклетъчния контур и С-терминалния регион, което от своя страна инхибира Cx43 хемиканалния отвор 12. Счита се, че подобен механизъм лежи в основата на действията на TAT-Gap24 върху хемиканали Cx32. За да се оцени специфичността на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 за блокиране на Cx хемиканали, но не и междинни връзки, беше извършено възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелващ анализ (FRAP) в хепатоцитни култури на плъхове (n = 4, N = 4) . По-специално, хепатоцитите на плъхове бяха изложени на 20 цМ TAT-Gap19, 20 цМ TAT-Gap24, 50 цМ карбеноксолон (CBX), известен инхибитор на Cx канали 17, или контрол на носител за 24 часа и 48 часа, 24 часа след посяването. Когато се използват с 20 μM, TAT-Gap24 и TAT-Gap19 не предизвикват цитотоксичност в хепатоцитни култури на първичния плъх (допълнение 1). CBX намалява възстановяването на флуоресценцията след 24 часа (стр
Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 върху експресията на протеин на коннексин в черния дроб. След 8 седмици CHFD, осмотична помпа е имплантирана хирургично в коремната кухина, осигурявайки продължително освобождаване от 1 mg/kg/ден на TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или физиологичен разтвор (n =) 14 ) за допълнителни 2 седмици, докато диетата продължава. Имуноблот анализ на Cx26 (21 kDa), Cx32 (27 kDa) и Cx43 (43 kDa) след разделяне и попиване, след което резултатите се нормализират до общия протеинов товар. Изображенията за кръпка се отрязват. Пълни петна с пълна дължина са показани в Допълнителна 4. Данните са изразени като средни стойности ± SEM.
Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 върху биометричните параметри, чернодробната хистология и серумните трансаминази
Относителното тегло на мазнините се е увеличило повече от два пъти и е било при мишки, хранени с CHFD (n = 14) в сравнение с мишки, хранени с ND (p 22. Всички резултати са били 0 в групата, хранени с ND (n = 10) и е имало такъв Увеличение на резултата за стеатоза (стр
Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 върху биометричните параметри и чернодробната хистология в NASH. След 8 седмици CHFD, осмотична помпа е имплантирана хирургично в коремната кухина, осигурявайки продължително освобождаване от 1 mg/kg/ден на TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или физиологичен разтвор (n =) 14 ) за още 2 седмици, докато продължавате диетата. а ) Тяло, мазнини и черен дроб на мишки и относително тегло на черния дроб и мазнините. ( б ) Стеатоза, лобуларно възпаление, образуване на балон и NAS резултат, базиран на оцветяване на хематоксилин-еозин в чернодробната тъкан от групата ND (първи панел), физиологичен разтвор (втори панел), TAT-Gap24 (трети панел) и TAT-Gap19 група (четвърти) Панел) панел). Данните са представени като средна стойност ± SEM с * p
Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 върху възпалителни цитокини и оксидативен стрес в NASH. След 8 седмици CHFD, осмотична помпа е имплантирана хирургично в коремната кухина, осигурявайки продължително освобождаване от 1 mg/kg/ден на TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или физиологичен разтвор (n =) 14 ) за още 2 седмици, докато продължавате диетата. ( а ) Нива на IFN-y, IL-6, IL-1β, TNF-α и IL-10 в чернодробната тъкан и серума. ( б ) Активност на SOD, GR, GPx и каталаза в чернодробната тъкан. Данните са представени като средно ± SEM с * p 27. Това се отнася и за глутатион редуктазата (GR), глутатион пероксидазата (GPx) и каталазата като антиоксидантни ензими 28. Всъщност мишките и хората с NASH имат намалени нива на глутатион, SOD и каталазни активности 27, 29. Интересното е, че в черния дроб на мишки, хранени с CHFD (n = 14), са установени по-високи GPx (p 30,). Подобни ефекти (p 31. За лимфоцитния антиген (LY) 86 не са открити разлики на ниво протеин (6 и допълнителни 5).
2, 5 ц М 12 се свързва, позволявайки на пептида да бъде уловен и задържан вътреклетъчно. Смята се, че Gap24 реагира подобно на Cx32 18. Както лекуваните с TAT-Gap24, така и третирани с TAT-Gap19 NASH мишки показват намалени нива на триглицериди, холестерол, IL-1β и по-големи количества SOD в чернодробната тъкан. В допълнение, TAT-Gap19 също намалява нивата на ALT и TNF-α, докато мишките, третирани с TAT-Gap24, имат по-ниски нива на IFN-y. - и имаше нива на IL-6. Трябва да се подчертае обаче, че неспецифичните ефекти като такива поради липсата на контрол на бъркани яйчни пептиди не могат да бъдат напълно изключени от това проучване. Нивата на активност на SOD, каталаза, GR и GPx обикновено се намаляват по време на NASH 27, 29, тъй като свръхпродуцираните реактивни кислородни видове могат директно да разграждат антиоксидантните молекули и да инхибират дейностите на антиоксидантните ензими Тъй като каталазата, GPx и SOD упражняват своята ензимна активност в тясна връзка помежду си 44, намаляването на активността на каталазата и GPx може да отразява компенсаторен механизъм за повишените нива на активност на SOD.
В обобщение, инхибирането на хх хемиканалите може да отвори перспективи за създаването на нови терапевтични стратегии за лечение с NASH.
Материали и методи
Животни и лечение
Изолация и култивиране на хепатоцити
Мъжки плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Белгия) бяха настанени при контролирани условия на околната среда със свободен достъп до храна и вода. Хепатоцитите се изолират, като се използва двустепенна перфузионна процедура с колагеназа, включително пречистване чрез серийно диференциално центрофугиране, и жизнеспособността на клетките се оценява чрез изключване на трипан синьо. Жизнеспособни (≥ 85%) хепатоцити с плътност 0,56 × 10 5 клетки на cm 2 в William's Medium E (Invitrogen, САЩ), допълнени със 7 ng/ml глюкагон, 292 mg/ml L-глутамин, антибиотици ( 7, 33 IU), натриев натриев бензилпеницилин, 50 ug/ml канамицин моносулфат, 10 ug/ml натриев амфицилин и 50 ug/ml стрептомицин сулфат) и 10% фетален говежди серум. След 4 часа, 24 часа и 48 часа средата за клетъчна култура се отстранява и замества със среда без серум, съдържаща 25 цт. g/ml хидрокортизон натриев хемисукцинат и 0,5. g/ml инсулин беше добавен. Процедурите за настаняване на плъхове, както и изолирането и култивирането на хепатоцити бяха одобрени от Етичния комитет за опити с животни на Vrije Universiteit Brussel (проект номер 14-210-1) и всички животни бяха тествани в съответствие с критериите от Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни ".
Възстановяване на флуоресценцията след фото избелване
За FRAP анализ 24 часа след клетъчно покритие, култивираните хепатоцити на плъхове се излагат на 50 цМ CBX, 20 цМ TAT-Gap24, 20 цМ TAT-Gap19 или контрол на носителя за 30 минути, 24 часа и 48 часа. FRAP анализът е извършен, както е описано по-горе 37. Флуоресценцията в избелената клетка се изразява като процент на възстановяване спрямо базовото ниво непосредствено преди фотоизбелването. Подобен анализ беше извършен на клетки, отстранени от избелената област, за да се наблюдава фотоизбелването извън целевата зона. Стойностите за възстановяване за всеки експеримент бяха нормализирани до подходящите условия за контрол на превозното средство. В допълнение, стойностите Y 0, плато, тау, полувремето и подвижната фракция бяха изчислени след напасване на нелинейна крива.
Измерване на извънклетъчния аденозин трифосфат
Извънклетъчно освободеният АТФ се измерва, използвайки търговски комплект за анализ на луциферин/луцифераза (Sigma, САЩ), както е описано по-горе 37. TAT-Gap24 и TAT-Gap19 бяха инкубирани за първи път при 37 ° С за 0 минути, 6 дни или 20 дни в класически инкубатор (Galaxy 170S, Ню Брунсуик, Германия). След това първични хепатоцитни култури на плъхове бяха изложени на 20 цМ TAT-Gap24, 20 цМ TAT-Gap19, 50 цМ CBX или контрол на носителя в продължение на 30 минути. Тези експерименти са проведени 24 часа след изолирането на първичните хепатоцити.
Хистопатологично изследване
Чернодробни тъканни проби се фиксират в 10% фосфатно буфериран формалин за 24 часа и се влагат в парафинов восък. Пробите бяха в 5. М-срезовете се изрязват и оцветяват с хематоксилин-еозин за оценка на стеатоза, хепатоцелуларен балон, лобуларно възпаление и NAS, както е описано по-рано Степента на стеатоза се оценява, като се използва следната 4-степенна скала, степен 0, която включва 66% от хепатоцитите. Възпалението на лобулите също е оценено по 4-степенна скала, а именно степен 0, без огнища; Степен 1, по-малко от 2 стада на поле × 20; Степен 2, 2 до 4 стада на поле × 20; Степен 3, повече от 4 стада на поле × 20. Образуването на балон от хепатоцити е оценено по 3-бална скала: 0, няма; 1, някои балонни клетки; 2, всякакви/изпъкнали балонни клетки. За NAS характеристиките на стеатозата, лобуларното възпаление и хепатоцитния балон бяха комбинирани със стойности от 0 до 8.
Анализ на серумни аминотрансаминази, серумни и чернодробни триглицериди и холестерол
Чернодробните липиди се екстрахират с хлороформ/метанол. По-специално, чернодробната тъкан се хомогенизира в 1 ml 2: 1 разтвор на хлороформ/метанол и се разклаща в Thermomixer (Eppendorf, Германия) при 22 ° С за 1 час. Пробите се центрофугират при 5000 х g в продължение на 10 минути, след което супернатантата се отстранява. След това, 200 .mu. Прибавя се L дестилирана вода и пробите се центрофугират при 8000 х g в продължение на 5 минути. Долната фаза се суши при 37 ° С за една нощ. Преди анализ липидите се разтварят в 400 µl бутанол (Sigma, САЩ). ALT, AST, триглицеридите и холестеролът се измерват с химичен анализатор (Labmax 240, Labtest, Бразилия). Резултатите са изразени в IU/l за AST и ALT, mg/dl за серумни триглицериди и холестерол и µg/mg за чернодробни триглицериди и холестерол.
Анализ на възпалителни чернодробни цитокини
Чернодробната тъкан се хомогенизира в лизисен буфер с протеазни инхибитори (Roche, Германия). Хомогенатите се центрофугират при 14 000 х g в продължение на 15 минути при 4 ° С и концентрациите на протеини в супернатантите се определят по Брадфордски метод 62, като се използва търговски комплект (Bio-Rad, САЩ) с говежди серумен албумин като стандарт. ELISA комплекти бяха използвани за измерване на нивата на IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ и TNF-α (BD Biosciences, САЩ) в черния дроб 63.
Анализ на чернодробните антиоксидантни ензими
Анализ на целия транскриптом
Имуноблот анализ
Имуноблот анализ на чернодробна тъкан е извършен, както е описано по-рано 63. Нитроцелулозните/PVDF мембрани бяха инкубирани през нощта при 4 ° C с първично антитяло, насочено към Cx26 (1/1000 разреждане), Cx32 (1/1000 разреждане), Cx43 (1/1000 разреждане), CD36 (1/250 разреждане), NADPH оксидаза (1/250 разреждане) и LY86 (1/500 разреждане) (Sigma, Белгия), последвано от инкубация за 1 h при стайна температура с подходящо вторично антитяло (1/1000 разреждане за Cx26, Cx32 и Cx43; 1/500 разреждане за CD36, NADPH оксидаза и LY86) (Дако, Дания). Денситометричният анализ беше извършен с помощта на софтуера Image Lab 5.0 (Bio-Rad, САЩ). За целите на полуколичественото определяне, сигналите бяха нормализирани спрямо общия протеин, измерени с гелове без петна и изразени като относителни промени в сравнение с животни, хранени с ND.
Статистически анализ
Броят на биологичните (n) и техническите (N) повторения за всеки анализ варира и е посочен при обсъждането на резултатите. Всички данни са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Резултатите бяха статистически обработени чрез еднопосочен дисперсионен анализ с post hoc корекция на Bonferroni. Всички данни са обработени с помощта на софтуера GraphPad Prism6, като стойностите на вероятността (p) по-малки от 0,05 се считат за значими.
Денят на благодарността
Авторите искат да благодарят на Dinja De Win, Tineke Vanhalewyn, Paul Claes и Steven Branson за тяхната всеотдайна техническа работа. Тази работа беше финансово подкрепена от безвъзмездните средства на Университета в Сао Пауло-Бразилия, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP SPEC grant 2013/50420-6 и 2016/16182-9), Европейския изследователски съвет ( ERC Starting Grant 335476), Фондът за научни изследвания-Фландрия (FWO отпуска G009514N и G010214N) и Университетската болница на Университета Врие Брюксел-Белгия („Willy Gepts Fonds“ UZ-VUB).
Допълнителни електронни материали
Допълнителна информация
Забележки
Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.