Индукция на миши чревни възпаления чрез възприемане на трансфер на Effector CD4 CD45RBhigh Т клетки

Резюме

Има много различни животински модели за изследване на патогенезата на човешкото възпалително заболяване на червата (IBD), всеки със своите предимства и недостатъци. Тук описваме експериментален модел на колит, който се инициира чрез адоптивен трансфер на сингеен далак CD4 + CD45RB с високи Т клетки в реципиенти на мишки с дефицит на Т и В клетки. Високата Т-клетъчна популация на CD4 + CD45RB, съставена до голяма степен от наивни ефекторни клетки, може да предизвика хронично чревно възпаление, много подобно на важни аспекти на IBD при хора. Тази процедура може да се манипулира, за да се изследват аспекти на появата и прогресията на заболяването. В допълнение, той може да изследва функцията на вродените, адаптивни и регулаторни популации на имунните клетки и ролята на факторите на околната среда, тоест микрофлората при чревно възпаление. В тази статия ние обясняваме метода за предизвикване на колит, използвайки стъпка по стъпка протокол. Това включва видео демонстрация на ключовите технически аспекти, необходими за успешното разработване на този модел мишка на експериментален колит за изследователски цели.

Протокол

ЗАБЕЛЕЖКА: Уверете се, че всички протоколи за животни са одобрени от и в съответствие с регламентите на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) и Наръчника на Националния съвет за изследвания за грижа и употреба на лабораторни животни. Донорните мишки могат да бъдат мъжки или женски, но реципиентните мишки трябва да са мъжки. Ако ще бъдат използвани жени реципиенти, мишките донори трябва да са жени 5. Поддържайте редовно колонии, като използвате нестерилни легла и некисела вода, тъй като те засягат чревната флора и по този начин фенотипа на колита на мишките 5,6.

  1. Използвайте ледено студена среда и буфери. Дръжте клетките на лед по време на експеримента.
  2. Извършете експеримента в стерилна качулка за биологични опасности, като използвате стерилна технология.

2. Изолиране на Т клетки на далака

3. Обогатяване на CD4 + Т клетки

Забележка: Следвайте инструкциите на производителя за конкретни продукти, използвани в този раздел.

4. Етикетиране и сортиране на клетки 7

чревни
Фигура 1: Типични графики на поточна цитометрия на CD4 + CD45RB Т клетъчни популации по време на FACS анализ (A. - ° С) FITC CD4- и PE CD45RB оцветени спленоцити от донорски мишки C57BL/6 бяха сортирани чрез FACS в CD4 + CD45RB високи и CD4 +. CD45RB популации с ниски Т клетки. (А) Дублетни събития, изключени в предния разпръснат парцел. (Б) Лимфоцитите бяха затворени в графики за разсейване напред и странично. (° С) CD4 + Т клетки бяха затворени и (Д) CD4 + CD45RB + Т клетки са нанесени на PE върху хистограма на събития. Счита се, че CD4 + CD45RB ниските клетки са най-ниските 20% от CD45RB + клетките. Високите клетки на CD4 + CD45RB бяха определени като най-високите 40% CD45RB + клетки.

  1. Пуснете аликвотна част от всяка клетъчна популация на машината FACS, за да оцените чистотата на популацията.
  2. Центрофугирани сортирани клетки при 450 g за 7 минути. Ресуспендирайте в 1 ml PBS. Премахнете аликвотни части от клетки, за да преброите и оцените жизнеспособността на клетките чрез изключване на трипан синьо, както в стъпка 2.9.

5. Инжектирането на клетки в реципиенти

  1. Ресуспендирайте сортирани клетки до 4 x 106 клетки/ml (CD45RB високо) или 2 x 106 клетки/ml (CD45RB ниско) в PBS.
  2. Прехвърлете 100 μl CD45RB високи клетки на получател в нови стерилни епруветки. Добавете 100 μl PBS на получател към тази епруветка. Общото инжектирано количество на животно е 200 μl, а общото количество клетки на реципиент е 4 × 10 5 CD4 + CD45RB силно наивни Т клетки.
  3. Ако се желае експериментална група, съдържаща регулаторни Т клетки, добавете 100 μl CD45RB клетки на реципиент в нови стерилни епруветки. 100 μL CD45RB ниски клетки на реципиент в същата епруветка. Общото количество за инжектиране на животно е 200 µl; Съотношението на CD45RB високо: CD45RB ниско клетки е 2: 1.
  4. Инжектирайте 100 μl CD45RB високи или CD45RB високи/ниски CD45RB CD4 + клетки интраперитонеално в дясната и лявата страна на корема (общо 200 μl) на всеки получател.

6. Мониторинг на прогресията на заболяването при животни реципиенти

  1. За да се оцени клиничното състояние на животните реципиенти, общите клинични резултати за следните параметри определят 8 в деня на инжектиране, седмично след това и при умъртвяване:
    1. Определете загубата чрез измерване на загуба на тегло: 0 - няма загуба на тегло; 1 - 0,1 до 10% загуба на първоначалното телесно тегло; 2 - над 10% загуба на първоначалното телесно тегло (Фигура 2А).

чрез
Фигура 2: Клинични и патологични признаци на възпаление след прехвърляне на диви CD4 + CD45RB високи Т клетки се наблюдават при Rag1 -/- и NRDKO реципиентни мишки 11 (A) Получателите на NRDKO са загубили средно 10% от първоначалното си телесно тегло 5. Седмици след предаването, докато Rag1/получателите не показват клинични признаци на заболяване по това време. Всяка точка представлява средния процент от първоначалното телесно тегло за кохорта ± SEM. ** P -/- и NRDKO реципиентни мишки са удебелени и съкратени в сравнение с дебелото черво от Rag1 -/- и NRDKO мишки без Т-клетъчен осиновителен трансфер. Дебелото черво на мишките реципиенти с NRDKO показва силно възпаление и повишено затлъстяване (данните не са показани). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Прибл. 10 x 106 CD4 + CD45RB високи Т клетки от 10 далака на възрастни мишки донори C57BL/6 са надеждно изолирани. Този брой ще варира в зависимост от възрастта и щама на донорската мишка и уменията на изследователя. Когато 4 х 105 C57BL/6 CD4 + CD45RB високи Т клетки се прехвърлят в реципиентни мишки C57BL/6 Rag1 -/-, клиничните признаци на заболяването се появяват около 5 седмици след насищането или по-рано, ако мишките са генетично предразположени към по-тежко заболяване ( Фигура 2, 3) 11.12. CD3 + Т клетки могат да се видят в дебелото черво при получателя на Rag1 -/- още 3 седмици (3A) 12.

чревни
Фигура 3: Предаване на CD4 от див тип + CD45RB с високи Т клетки в Rag1 -/- и RKO/δ KD получатели предизвикват хронично възпаление на червата 12 (A) (Оригинално уголемяване 10X, H&E и CD3 Имунохистохимия). H&E оцветяването (горните панели) показва епителна хиперплазия, инфилтрирани възпалителни клетки и абсцеси на крипти (стрелка), присъстващи в RKO/δ KD реципиент, но не и Rag1 -/- реципиент. Дебелото черво от RKO/δ KD реципиентни мишки показва значително натрупване на CD3 + Т клетки от CD3 IHC (дънни плочи) в сравнение с дебелото черво от Rag1 -/- реципиенти. (Б) Дебелото черво от RKO/δ KD реципиентни мишки показва по-тежко възпаление в сравнение с дебелото черво от Rag1 -/- реципиентни мишки, както е определено чрез хистологично точкуване. (C, D) Експертни култури на дебелото черво от мишки реципиенти на RKO/δ KD секретират по-малко IL-10 (° С) и IL-12p40 (Д) отколкото направено култивиране на експлантиране на дебелото черво на Rag1 -/-. Приемни мишки, моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на изображението.

Преди това публикувахме, че приемащият Т-клетъчен трансфер при Nfil3 -/-/Rag1 -/- получатели с двойно нокаутиране (NRDKO) развива тежък колит в сравнение с Rag1 -/- реципиентни мишки (Фигура 2) 11. NFIL3 регулира отрицателно IL-12p40 в макрофаги на дебелото черво при мишки, независимо от неговия индуциращ ефект на IL-10 13. Дисрегулирането на IL-12p40 и IL-10 е в патогенезата на IBD при хора 1. По този начин непровереното производство на IL-12p40 при приемния трансфер Мишките получатели на NDRKO причиняват по-бързо прогресиране на заболяването, като загуба на тегло (2А) показани. Някои мишки получатели на NRDKO са развили сериозно заболяване, което е довело до пролапс на червата (2 Б). Грубите дебело черво от мишките реципиенти на NRDKO са удебелени и съкратени, което води до голяма имиграция на възпалителни клетки в дебелото черво, в сравнение с Rag1 -/- мишки реципиенти (2C).

Сравнително при Rag1 -/- мишки с нефункционална каталитична p110 δ PI3K единица в нелимфоцитни популации (RKO/δ KD), CD4 + CD45RB високи Т клетки индуцират подобно бързо и сериозно клинично протичане на заболяването в сравнение с пренапълване NRDKO мишки (3) 12. Хистологичният анализ след 3 седмици показва хипертрофия на тъканите на дебелото черво, възпаление, инфилтрати на Tory клетки и абсцеси на крипта (стрелка) в RKO/δ KD реципиент в сравнение с Rag1 -/- реципиент (3A). Получаващите мишки в този експеримент бяха евтаназирани в продължение на 3 седмици поради значителен брой, които бяха загубили 20% от първоначалното си тегло. Хистологичните резултати, като заслепени от тестовите групи от патолог и определени въз основа на специфични критерии, разработени в нашата лаборатория 12, в сравнение с Rag1 са по-високи при RKO/δ KD реципиентни мишки -/- реципиентни мишки (3B). В допълнение, спонтанното производство на цитокини от експлантирани от дебелото черво култури показва намалено производство на IL-10 и IL-12p40 от RKO/δ KD реципиентни мишки в сравнение с Rag1 -/- реципиентни мишки (3C, D) 12. Отново, увеличен IL-12p40 и намалено производство на IL-10, замесени в патогенезата на IBD при хора 1.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Тук ние описваме стъпка по стъпка протокол за индуциране на възпаление на дебелото черво при мишки чрез адоптивен трансфер на CD4 + CD45RB + Т клетки в имунодефицитни мишки. Използвахме C57BL/6 донор далак и сингенни Rag1 -/- реципиентни мишки, въпреки че други щамове (напр. BALB/c, 129S6/SvEv, не затлъстял диабет (NOD)) и генетични модели на имунна недостатъчност (напр. SCID, Rag2 -/- ), може да се използва и 4,14-16. Добре известно е, че фоновият щам влияе върху тежестта на експерименталния колит при мишки 1. В допълнение, ентералната микрофлора в миша популация варира значително между институциите, включително между тези в същата институция 6,17. Докато 2 и 3 не показва развитието на колит при Rag1 -/- мишки след 4 седмици след трансфера, според нашия опит и този на други Rag1 -/- реципиенти за развитие на кликоза болест между 6 и 9 седмици след трансфера на CD4 + CD45RB високо -T -Клетки 18-23. Тази променливост в клиничното протичане и експресията на заболяването и трябва да се поддържа възможно най-ниска при определяне на този модел на експериментален колит на интра- и междуекспериментално несъответствие.

Стъпките на протокола, които изискват оптимизация, са Раздел 3: Обогатяване на CD4 + Т клетки и Раздел 4: Етикетиране и сортиране на клетки. Оптимизирането на обогатяването на CD4 + Т клетки зависи от използваната магнитна система и трябва да следва инструкциите на производителя. Опциите за система за магнитно разделяне на клетки са предвидени в Таблица на специфични реактиви/аксесоари изброени. Препоръчително е обогатяването на CD4 + Т клетки чрез отрицателна селекция, тъй като директното маркиране на тази популация може да повлияе на фенотипа на клетките. Налични са много клонове на антитела за маркиране на клетки за FACS. Концентрацията на антителата (стъпка 4.4) трябва да бъде оптимизирана, за да се осигури специфично оцветяване и адекватно разделяне на CD4 + CD45RB Т клетъчни популации по време на FACS.

Тук описваме методологията на добре характеризирания адаптивен миши модел на хронично възпаление на тънките черва и дебелото черво, който прилича на човешки IBD 5. Този протокол стъпка по стъпка предоставя ключови техники за успешно разработване на тези процедури за изследователски цели. Това е особено полезен животински модел на IBD при хора, защото позволява да се синхронизира болестта и да се манипулират различни клетъчни популации. Въпреки това, имунокомпрометираните реципиентни мишки са генетично модифицирани, без да се развиват зрели адаптивни имунни клетки, които е вероятно да повлияят на болестните процеси надолу по веригата. Независимо от това, методът, описан тук, ще се окаже много полезен в бъдещи проучвания, определящи ефектите на ентералната микрофлора, вродените клетки на имунната система и адаптивните клетки на имунния регулатор в патогенезата на IBD при хора.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от наградата на учените за изследване на Американското общество за гастроентерология (AGA) и наградата за кариерно развитие на Crohn and Colitis Foundation of America (CCFA) (SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) и Центъра за гастроинтестинална биология на Университета на Северна Каролина и грантове за болести P30 DK34987 (Хистологично ядро). Основният механизъм за поточна цитометрия на UNC се подпомага отчасти от гранта за основна подкрепа на NCI Center (P30CA016086) в Центъра за ракови заболявания на UNC Lineberger. Благодарим на Лукас Борст от Колежа по ветеринарна медицина на държавния университет в Северна Каролина за помощта при хистопатологичен анализ и имунохистохимия.