Химична ампутация и регенерация на фаринкса в планарската Schmidtea med Mediterraneana

Обобщение

Planarian Schmidtea Mediterranea е отличен модел за изучаване на стволови клетки и регенерация на тъканите. Тази публикация описва метод за селективно отстраняване на орган, гърлото, чрез излагане на животните на химичния натриев азид. Този протокол описва също методи за наблюдение на регенерацията на гърлото.

Резюме

Планариите са плоски червеи, които са изключително ефективни при регенериране. Те дължат тази способност на голям брой стволови клетки, които могат да реагират бързо на всякакъв вид нараняване. Често срещаните модели на нараняване при тези животни премахват големи количества тъкан, която уврежда множество органи. За да се преодолее това широко увреждане на тъканите, тук описваме метод за специално отстраняване на един орган, гърлото, в Planarian Schmidtea Mediterranea. Постигаме това чрез накисване на животни в разтвор, съдържащ инхибитора на цитохром оксидазата натриев азид. Краткото излагане на натриев азид причинява екструзия на гърлото на животното, което ние наричаме „химическа ампутация“. Химичната ампутация премахва целия фаринкс и създава малка рана, където фаринкса лежи в червата. След обширно изплакване всички ампутирани животни регенерираха напълно функционално гърло за около седмица. Стволовите клетки в останалата част на тялото стимулират регенерацията на новото гърло. Тук предоставяме подробен протокол за описание на химична ампутация и хистологични и поведенчески методи за оценка на успешната ампутация и регенерация.

Въведение

Регенерацията е явление, което се случва в цялото животинско царство, като регенеративните способности варират от регенерация на цялото тяло при някои безгръбначни до по-ограничени възможности при гръбначните животни 1. Подмяната на функционални тъкани е сложен процес и често едновременното възстановяване на множество типове клетки предполага. Например крайниците на саламандрата, остеобластите, хондроцитите, нервните клетки, мускулите и епителните клетки трябва да се регенерират 2 заменени. Освен това тези новосъздадени типове клетки трябва да бъдат правилно организирани, за да улеснят новата функция на крайника. Разбирането на тези сложни процеси изисква техники, които се фокусират върху регенерацията на специфични клетъчни типове и тяхната интеграция в органи.

Една от стратегиите за опростяване на изследването на регенеративните отговори е целенасочената аблация на специфични клетъчни типове или по-големи колекции от тъкани. Например, експресията на нитроредуктаза в някои клетъчни типове при ребрата зебра води до тяхното унищожаване след употребата на метронидазол 3, 4. В ларвите на Drosophila, аблиращи, експресиращи проапоптотични гени под тъканно специфични промотори, насочени към определени региони на имагиналния диск 5, 6. И двете стратегии причиняват бързи, но контролирани щети и са били използвани за дисекция на молекулярните и клетъчните механизми, отговорни за регенерацията.

В този ръкопис ние описваме метод за селективно отстраняване на цял орган, наречен фаринкс в Средиземноморието на планарската Schmidtea. Планарианците са класически модел на регенерация, известен със своя плодороден регенеративен капацитет, при който дори най-малките фрагменти от цели животни 7, 8 израстват обратно. Те имат голяма, хетерогенна популация от стволови клетки, състояща се от плурипотентни клетки и родоначалници с ограничен произход 9, 10, 11. Тези клетки се размножават и диференцират, за да заместят липсващите тъкани, включително гърлото, нервната, храносмилателната и отделителната системи, както и мускулните и епителните клетки 9, 10, 12. Знаем, че тези стволови клетки инициират регенерация, не разбираме напълно молекулярните механизми, които ги карат да заменят тези различни видове клетки. Определените наранени методи, които могат да предизвикат прецизни реакции на стволови клетки, помагат да се ограничи този сложен процес.

Фаринксът е голяма цилиндрична тръба, необходима за хранене и съдържа неврони, мускули, епителни и секреторни клетки 13, 29. Обикновено скрит в джоба на корема на животното, той се простира през тялото на животното, за да се отвори, усещайки наличието на храна. За да се ампутира селективно фаринкса, ние накисваме планарии в химикал, наречен натриев азид, често използван анестетик при C. elegans 14, 15, 16 Използването му в планарии е съобщено за първи път от Adler et al., 2014-12. В рамките на минути след излагане на натриев азид планариите екструдират фарингите си и с леко раздвижване на фаринкса отделят животното. Тази пълна и селективна загуба на гърлото е това, което наричаме „химическа ампутация“. Една седмица след ампутацията, напълно функциониращото гърло се възстановява на 12-то Тъй като фаринксът е необходим за хранене, функционалната регенерация може да бъде измерена чрез наблюдение на поведението при хранене. По-нататък описваме протокола за химическа ампутация и за оценка на регенерацията на гърлото и възстановяване на поведението при хранене.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

3. Оценка на отстраняване на фаринкса след ампутация

Разгледайте животните под микроскоп (с увеличение 10-20X), за да видите дали се е появило тъмно петно след премахване на избора на гърлото, както е на фигура 2Апоказани.
Алтернативно, фиксирайте и избелете животни съгласно протокола на Pearson et al. описани 20. Накиснете животните за една нощ в 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или конюгиран стрептавидин с тъканна култура (1 mg/ml, разреден 1: 500, 1x фосфатно буфериран физиологичен разтвор с 0,3% Triton-X). Животни на предметни стъкла в 80% глицерол/20% 1Х фосфатно буфериран физиологичен разтвор и изображение под флуоресцентен стереомикроскоп (фиг. 2 b) монтиране.
Забележка: Всички изображения в този ръкопис са заснети на флуоресцентен стерео микроскоп с мишена 1.0X.

4. Оценка на регенерацията на фаринкса чрез измерване на поведението при хранене

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Излагането на натриев азид нарушава нормалната подвижност на планариите, карайки животните да се разтягат и да се гърчат. Тези движения принуждават гърлото да излезе от вентралната страна на животното и след около 6 минути. в разтвор на натриев азид се вижда белият връх на гърлото (Фигура 1 b-наляво). Няколко минути по-късно животните активно се свиват и напълно разширяват гърлото, като го изтласкват от тялото. (Фигура 1 b-Център). Отпуснете се около 11 минути. след излагане на азид, животните и гърлото. На този етап типичната камбанна форма на гърлото е ясно видима (Фигура 1 b-десен прозорец). За проста ампутация е важно да изчакате фаринкса да се отпусне.

Тъй като фаринксът е голяма, непигментирана маса тъкан, той премахва появата на тъмно петно от гръбната страна на ампутираното животно (Фигура 2А). Този тъмен регион е визуална индикация за успешна ампутация с живи животни. Петното се вижда веднага след ампутацията и става по-забележимо на следващия ден. С регенерирането на фаринкса този регион се успокоява. За да се наблюдава по-внимателно регенерацията на фаринкса, животните могат също да бъдат оцветени с DAPI или тъканни култури, конюгирани със стрептавидин за една нощ (Фиг. 2 б). За да се оцени количествено степента на регенерация на гърлото, площта му може да се измери със софтуера ImageJ.

илюстрация 1 . Фарингеално отхрачване и ампутация. (А) Схематично представяне на анатомия на планария. (Б) Изображенията на живо показват фарингеални храчки след накисване в 100 mM натриев азид. Червени стрелки маркират гърлото. Мащабиращи пръти = 750 µm. (° С) Снимка на живи животни (вляво) и електрическа схема (вдясно) на ампутацията с пинсета. Панелите показват две различни възможности за хващане за гърлото. Коремът на животното е обърнат нагоре. Мащабиращи ленти = 500 µm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 2 . Оценка на ампутация и регенерация на гърлото. (А) представителни снимки на живи животни в определени моменти преди и след ампутацията. В средната област се вижда тъмно петно във фарингеалната област след ампутация, подчертано с пунктирано бяло поле. Гръбната страна обърната нагоре. Мащабиращи ленти = 500 µm. (Б) представителни изображения на животни, оцветени с Alexa488-стрептавидин в определени моменти преди и след ампутацията. Средният панел показва липсата на гърлото след ампутация. Фарингеалната област, подчертана с бяла кутия. С лице нагоре. Мащабна лента = 500 µm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 3. Оценка на регенерацията на гърлото. (А) Снимки и схеми на анализа за хранене, извършен чрез поставяне на 25 µl от черния дроб в центъра на 60 mm чаша на Петри. Схемата на веригата (отгоре, вляво) и картината (в центъра) показват поведението на хранене при животни с непокътнати фаринги. Горе вдясно, снимка на животното, което е яло. Електрическа схема (долу вляво) и снимка (в центъра) на поведението при хранене при животните 1 ден след ампутация. Отдолу вдясно, животно, което не е яло. Мащабна лента = 750 µm. (Б) Резултати от анализа на храненето. Делът на животните, консумирали храна (количествено определена чрез червено оцветяване) в определени моменти след ампутация. За всеки момент във времето n = 10 животни, повторени в три екземпляра. Лента за грешка = SD Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Този протокол описва метод за селективно аблация на гърлото с натриев азид. По-нататъшни проучвания за аблация при планарии са използвали модифицирана хирургия за отстраняване на фоторецептори 21 или фармакологично лечение за аблация на допаминергичните неврони 22. Голямо предимство на химическата ампутация пред съществуващите методи е, че тя не изисква операция. Твърдата структура на гърлото в сравнение с останалата част от планарското тяло улеснява пълното му отстраняване на животното, което е много по-меко тяло. Фаринксът също така разделя животното в малък кръстопът (хранопровод) 30, свързващ фаринкса и червата, генерирайки по-възпроизводима рана, отколкото индуцирана от по-голям хирургичен инструмент. Поради неговите физични свойства и малка анатомична връзка с останалата част от животното, премахването на фаринкса следователно създава по-хомогенни рани от други хирургически ампутации.

Продължителността на излагане на натриев азид също е от решаващо значение за успеха на тази техника. Въпреки че краткото излагане на натриев азид не засяга неблагоприятно планариите, дългите периоди от време са отровни и в крайна сметка ще убият животните. Известно е, че натриевият азид инхибира енергозависимите процеси чрез инхибиране на цитохром оксидазата 23,24. В допълнение, той потиска транскрипцията и транслацията, вероятно чрез натрупването на ключови компоненти на тези реакции в стрес гранули 25. При планарии експозицията на натриев азид потиска митозата за 24 часа, след което клетките продължават пролиферацията 12. Промени като Б. Ограничаване на продължителността на излагане на азиди, елиминиране на натриев азид с цялостно промиване и балансиране на защитата от митотичен пренапрежение в експерименталния дизайн може да помогне за преодоляването на тези граници.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите не са разкрили нищо.

Благодарности

Бихме искали да благодарим на Алехандро Санчес Алварадо, който съдейства за първоначалната оптимизация и развитие на тази техника. Лабораторията на Каролин Адлер се подпомага от първоначални пари от университета Корнел.