Характеризиране на метаболитния статус при нечовешки примати с интравенозна глюкозна толерантност
Обобщение
Целта на този протокол е да представи стандартен метод за интравенозни тестове за толерантност към глюкоза (IVGTT) за извършване на гликемичен контрол при нечовекоподобни примати за оценка и оценка на техния метаболитен статус от здрав до дисметаболитен.
Резюме
Въведение
IVGTT е удобен функционален анализ, който се използва рутинно за определяне на функцията на β-клетките при хора при различни метаболитни условия 5, 7. В животинските модели на T2D е добре познат като инструмент за характеризиране на животни, които показват от прогресия на метаболитното заболяване здраво до дисметаболично хипергликемично състояние 8, 9. Най-близкият животински модел на T2D е показан при нечовешки примати (NHP), един от които е резус и Макаките Cynomolgus са забележителни примери. Тези животни естествено развиват T2D със същите рискови фактори на възрастта и затлъстяването, допринасящи за неговата честота, както при хората 10. В допълнение, има подобна прогресия на заболяването и патология на панкреаса, показващи амилоидни отлагания с напредването на дисметаболитна болест 11.
Тук докладваме за нашата стандартна процедура за получаване на IVGTT в NHPs като част от нашата колониална характеристика на метаболитния статус при тези животни. Този метод е лесен в сравнение с други, по-отнемащи време и скъпи техники 2. IVGTT е полезен за бързо и често характеризиране на голяма колония животни. Когато се вземе предвид с нивата на гликиран хемоглобин (HbA1C), диетата на животното и историята на приема на храна и процентът на мускулна маса и телесни мазнини, IVGTT обикновено е достатъчен за характеризиране на метаболитния статус на животното и прогресирането му до явен диабет 8.
HbA1C представлява средното ниво на гликемия през живота на червените кръвни клетки, осигурявайки надеждна мярка за нивата на глюкозата през последните шест седмици до три месеца. Когато се измерва от основната кръвна проба на IVGTT, тази стойност осигурява прозорец за гликемичен контрол през месеците между процедурите. Ако животното е преминало от дисметаболичен от последния им IVGTT, стойност на HbA1c много по-висока от предишната им стойност при диабет би означавало, че преходът е започнал скоро след последния им IVGTT, докато стойност на HbA1c по-близо до предишната им стойност ще означава, че те наскоро са превключили. Обикновено при резус макаците нивата на HbA1C над 6% са ненормални и предполагат лош контрол на кръвната захар 10, 23.
Гликемичните нива трябва да се тълкуват от гледна точка на поведението и общото здравословно състояние на животното като цяло. Диабетичните макаци - като хората - проявяват хиперфагия, полидипсия и полиурия. Груповото настаняване на животни представлява значителни предизвикателства за измерването на тези показатели и индивидуалните грижи, необходими за диметаболитни и диабетни маймуни. Препоръчваме да се настаняват животните поотделно, за да могат да се осигурят повече лични грижи и да се наблюдават по-лесно маркерите за поведение за здравето на маймуната 8. В допълнение, диабетичните макаци ще покажат загуба на тегло, повишен липиден профил (повишен холестерол, хипертриглицеридемия) и нарушен минерален метаболизъм в серумната химия. Важно е да се измерват маркери на чернодробната и бъбречната функция в серумната химия, тъй като увреждането на тези органи често напредва от усложнения метаболитно разстройство/диабет и заедно могат да бъдат определящи за гликемичния, липидния и минералния дисбаланс 9, 11, 18, 24, .
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички процедури за животни на изследователския институт на Дейвид Х. Мърдок IACUC, разположен в изследователския кампус на Северна Каролина (NCRC), бяха одобрени съгласно протокол 14-017, характеризиращ нечовешки модел на примати на диабет и преддиабет/инсулинова резистентност и ефикасност на терапевтичните средства за подобряване на инсулиновата чувствителност и метаболитна функция.
1. Подбор на животни и подготовка за проучване
2. Седация и подготовка на животни
ЗАБЕЛЕЖКА: Процедурата IVGTT се състои от 8 точки за вземане на кръв във времето (Маса 1).
100 mg/dl по-високи от изходните плазмени нива на глюкоза на гладно.
4. Спасяване на животни и обработка на проби
- Отстранете канюлите и приложете натиск върху катетеризираните места за хемостаза след точката от време T30 min. Наблюдавайте животното, докато то дойде в съзнание и седне. Предложете фураж, след като животното се възстанови напълно.
- Веднага след това всяка проба от цяла кръв е в епруветки K 2 EDTA върху лед. Центрофугирайте при 3000 оборота в минута при температура 4 ° C в рамките на 10 минути от събирането. Аликвотни плазмени проби в криовиази, замразяват и съхраняват при -80 ° C до анализ.
- Оставете кръвта в серумната епруветка за стандартен серумен химичен анализ да престои при стайна температура за не по-малко от 20 минути и не повече от 30 минути преди центрофугиране при 3000 rpm при RT. Замразете пробите от серума, докато бъдат изследвани в рамките на 48 часа след събирането.
ЗАБЕЛЕЖКА: Пълна кръв в хладилник, събрана за CBC анализ, до и след 24 часа след събирането на Sayed.
- Оставете кръвта в серумната епруветка за стандартен серумен химичен анализ да престои при стайна температура за не по-малко от 20 минути и не повече от 30 минути преди центрофугиране при 3000 rpm при RT. Замразете пробите от серума, докато бъдат изследвани в рамките на 48 часа след събирането.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Резултатите са в илюстрация 1 Показани са демонстративни типични криви на глюкоза и инсулин от зрели, здрави и диабетични макаци cynomolgus в продължение на 30 минути IVGTT. Данните от здрави и напреднали маймуни с диабет са в контраст с очевидните разлики между животните от двата крайни края на обхвата на метаболитната характеристика. Този IVGTT протокол беше успешно използван от авторите в резус макаци с подобни резултати.
Гладните изходни нива на глюкоза на здравословен макак (резус и циномолгус) могат да достигнат до 50 до 60 mg/dl 8. Както е показано на фигурата, първоначалната екскурзия на глюкоза - измерена при Т3 - за здрав NHP може да не се изкачи толкова високо, колкото типичната изходна стойност на глюкозата за животно с диабет, което често надвишава 200 mg/dL. В течение на следващите тридесет минути нивата на глюкоза често се връщат към първоначалните си стойности при здрави животни, докато дисметаболитни и диабетни животни не (Илюстрация 1; плътни линии). Придружаващата крива на инсулина за здраво животно показва два върха (Илюстрация 1; синя прекъсната линия), които съответстват на първоначалното, бързо намаляване на кръвната захар (фаза 1), медиирано в по-голяма от нормалната част от периферните ефекти на инсулина върху транспорта и приема на глюкоза 3, 4. степента на тези периферни ефекти, дори по време на първата Фазата на инсулиновия отговор не намалява приноса на черния дроб, равен на глюкозата, който по време на по-малкия, но постоянен втори пик на инсулин (фаза 2) оказва най-голямо влияние върху гликемичните нива чрез потискане на ендогенното производство на глюкоза 1.
Тъй като животното преминава към дисметаболитно от здравословно, обикновено има намаление в първата фаза на инсулиновия отговор към болуса на декстроза, който при намален въздух може да бъде отразено. както и да е AUC остават непроменени, тъй като ще има общо увеличение на производството на инсулин по-често, осигурявайки до голяма степен непроменени гликемични нива по време на процедурата, тъй като увеличеното производство на инсулин компенсира намаляването на чувствителността. След като животното стане явно диабет, производството на инсулин намалява драстично в отговор на болуса на декстроза (1; пунктирана червена линия). Гликемичните нива ще останат повишени по време на процедурата, както и това, което глюкозният клирънс сега се случва почти изцяло от неинсулинозависими механизми (1), се предава.
| Време | The Пъти (мин) | Реално време | Количество кръвна проба (ml) | Анализ - пример | Отчитане на глюкоза (mg/dl) | |
| Базова линия | 5 мл | 1,5 ml SST - химия 0,5 ml К 2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 ul Prot -. Глюкоза, инсулин, C-Pep | ||||
| 0 | Инфузия с декстроза от 250 mg/kg интравенозно за 30 секунди, последвана от 5 ml физиологичен разтвор на хепарин | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 7-ми | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 15-ти | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 20-ти | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
| 30-ти | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Глюкоза, Ins, C-Pep | ||||
маса 1:. Таблица с процедури на IVGTT Показва се стандартен доклад за процедурата за IVGTT, включващ цялата подходяща информация по време на процедурата. Времената за аспирации на проби след инфузията с декстроза трябва да се изчисляват от края на инфузията. Действителните часове трябва да се записват за всяко теглене. Моля, кликнете тук, за да изтеглите тази таблица като документ на Microsoft Word .
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
IVGTT оценява способността на стимулирано от глюкоза освобождаване на инсулин чрез единична инфузия на декстроза на базата на телесно тегло 5, 12, 13. От теста се постига кръвната захар и нивото на инсулин на гладно и позволява оценка на способността на животното да отделя инсулин и връща повишеното ниво на глюкоза към изходното ниво. Това предоставя на потребителя информация за характеризиране на животното като нормален здрав контрол на нивото на глюкоза и инсулин, хиперинсулинемично дисметаболитно животно с нормогликемия или хипергликемично инсулиноустойчиво диабетно животно.
IVGTTs са ограничени от способността им да измерват директно инсулиновата чувствителност. Той е полезен преди всичко като метод за оценка на производството на инсулин и глюкозния клирънс. Въпреки това, извличането на чернодробен инсулин от порталното кръвоснабдяване нарушава измерванията на "секрецията на инсулин" от системното кръвоснабдяване. Това обаче може да бъде частично преодоляно чрез измерване на С-пептида, който се секретира в еквимоларни количества от панкреаса, но не се отстранява от черния дроб, преди да влезе общото кръвоснабдяване. Това дава по-добра представа за производството на инсулин, за да се оцени по-добрата функция на β-клетките 16. IVGTT също не правят разлика между инсулинозависими механизми на глюкозния клирънс и неинсулинозависими механизми 1, 6. Докато инсулиновата чувствителност може да бъде оценена индиректно чрез минимално моделиране на данни от IVGTT, по-надеждни мерки могат да бъдат постигнати чрез използване на методи като степенувана инфузия на глюкоза (GGI), който осигурява 14-крива доза-отговор β клетки, 15.
Въпреки това, инсулиновата чувствителност се оценява само косвено с GGI. По време на IVGTT на животното може да се прилага стандартна доза инсулин, за да се подобри оценката на инсулиновата чувствителност, но това ще маскира ендогенното производство на инсулин от влошаване на оценката на функцията на β-клетките. Техниките за хипергликемична и хиперинсулинемична скоба директно измерват регулирането на глюкозата чрез контролирана експозиция на инсулин. Недостатъкът както на GGI, така и на притискащите техники е, че те са скъпи за изпълнение и изискват повече работна сила и време (понякога до шест до осем часа, в зависимост от дизайна на процедурата), за да се изпълни. IVGTT, от друга страна, може може да се извърши за по-малко от час и с минимален труд.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите са активно свързани с договорно изследователски институт (Crown Bioscience) в областта на метаболитните заболявания.