ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЖИВОТНИ ОТНОСНО ИЗВЪРШВАНЕТО НА ФАРМАКОНОВИ БИОРАЗГРАДИМИ
1 Клиника и поликлиника за обща, гръдна, съдова и трансплантационна хирургия на Медицинския университет в Рощок ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЖИВОТНИТЕ НА ИЗПИТВАНЕ НА ВЪЗДЕЙСТВИЕ НА ФАРМАКОНОВИ НАРУЖАЕМИ БИОГРАДИМИ ПОЛИЛАКТИДНИ СТЕНТИ Инаугурационна дисертация за придобиване на академична степен от Университета в Росток, роден доктор по медицина в Краснодар. Росток, 2007 урна: nbn: de: gbv: 28-дис
2 декан: проф. Д-р med Wolfgang Schareck 1-ви рецензент: 2-ри рецензент: 3-ти рецензент:
3 В знак на благодарност към родителите ми
4 СЪДЪРЖАНИЕ. 1 1 ВЪВЕДЕНИЕ Стентове в съдовата хирургия Установени индикации и иновативно стентиране на каротидната артерия Идеалният стент Метален стент Проблеми на имплантирането на стента: Тромбоза и рестеноза Стратегии за разтвор Антитромботици Метален стент с освобождаване на лекарството: Sirolimus Биоразградими стентове Метален стент и полимерен стент с освобождаване на лекарства МАТЕРИАЛИ METOD RELEGEE Стентове Тестови животни и предоперативно лечение Анестезия, интубация и вентилация Мониторинг и медикаментозно лечение Хирургична процедура Модел на аналикоза с псевдоним Модел на АСС Следоперативно лечение и проследяване Вземане на проби и хистология Статистическа оценка РЕЗУЛТАТИ Модел на анастамоза на псевдоним Хирургична процедура Последващи действия Хистологична оценка Модел на АСС Хирургическа процедура Хистологична оценка
5 5 ДИСКУСИЯ Свински модел Биологични и физични свойства на PLLA стента In vivo тестване на полимерен стент РЕЗЮМЕ СПИСЪК НА ЛИТЕРАТУРАТА СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ СПИСЪК НА ТАБЛИТЕ НАУЧНА ЕФЕКТИВНОСТ ТЕКУЩА КУРИКУЛ САМА ОТГОВОРНОСТ
12 Поддържащата функция на металния стент може до голяма степен да помогне за предотвратяване на еластичен откат, но не може да инхибира неоинтималната хиперплазия, което е друг решаващ фактор в патогенезата на рестенозата на стента [47]. Фиг.1: Рестеноза в стента поради неоинтимална хиперплазия, вляво: хистологично сечение, вдясно: макроскопично изображение на напречно сечение, [с любезното съдействие на MB Leon, Presbyterian Hospital, Ню Йорк, САЩ.] Това показва реакцията на съдовата стена на най-фините механични лезии След дендулация на ендотел, излагането на субендотелни структури на кръвния поток води до възпалителна реакция на съдовата стена. Чрез освобождаването на цитокини и растежни фактори като растежен фактор, получен от тромбоцити (PDGF), епидермален растежен фактор (EGF), ß трансформиращ растежен фактор (TGF ß) и хепаринази, това води до активиране и пролиферация на гладкомускулни клетки в туниката медии. След 9
14 контролна група [52]. Локалното хепариново покритие на стентове е клинично установено след публикуването на проучването BENESTENT II [53]. Метален стент с освобождаване на лекарството: За да се намали неоинтималната хиперплазия и по този начин при рестенозата на стента, има смисъл да се използват терапевтични средства локално. Те трябва да инхибират възпалителната реакция на съдовата стена и да блокират пролиферацията на гладкомускулните клетки. Таблица 1: Фармакологични средства Противовъзпалителни за намаляване на рестеноза Immunodulatoren анти-миграция инхибитори Proliferativa Reendothelisationsfaktoren дексаметазон М-преднизолон интерферон у-1b, лефлуномид, сиролимус, такролимус, еверолимус zotarolimus микофенолова мизорибин циклоспорин актиномицин метотрексат angiopeptin, винкристин, митомицин статини батимастат пролил хидроксилаза инхибитори, халофугинон C-протеиназни инхибитори, пробукол BCP671 VEGF Естрадиол NO донори EPC антитела 11
22 Neointimal Hyperplasia Injury Score Степен на нараняване на възпалителната оценка на възпалителната стена на съдовата стена Степен на възпаление Събраните данни се анализират, сравняват помежду си и се обсъждат във връзка с in vitro изследвания на стента PLLA, които са регистрирани в Института по биомедицинско инженерство към Университета в Росток. 19-ти
23 3 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 3.1. Стентове Металните стентове (Phainon 6,0 x 26 mm, диаметър на подпората 155 m) са направени от неръждаема стомана (316L) с аморфно покритие от силициев карбид и след това са стерилизирани с газ. Дизайнът съответства на предлаганата в търговската мрежа система PEIRON (Biotronik GmbH & Co. KG, Берлин, Германия). Балонният катетър се използва за разширяване до 8 бара за секунди без риск от разкъсване на стента. Биоабсорбиращите се поли-L-лактидни (PLLA) стентове са разработени и произведени в Института по биомедицински технологии към Университета в Росток Warnemünde [16]. Фиг. 2: Разширяем с балон PLLA стент преди (A) и след (B) балона дилатация Дължина на гредата = 10 mm. 20-ти
24 Поли L лактид с високо молекулно тегло (PLLA; Resomer L214, MG = g/mol, Boehringer, Ingelheim, Германия) без добавки се използва за производство. В контролиран от компютър, частично автоматизиран процес на нанасяне на покритие (потапяне), корпусите на сърцевината от неръждаема стомана (диаметър 2,8 mm, дължина 40 mm) се спускат в разтвор PLLA/хлороформ с помощта на водолазен робот. Разтворът се зарежда автоматично с помощта на спринцовка, за да се гарантира, че потапящите ядра са равномерно навлажнени. Процесът на потапяне се повтаря, докато се създаде яке с желаната дебелина на стената от 270 m. Това се измерва без контакт с двуосова лазерна измервателна глава (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Орпунд, Швейцария). След това полимерните епруветки се изваждат от буталото със скалпел и се сушат под вакуум при 40 ° С, докато се достигне съдържание на хлороформ под 2%. За отстраняване на остатъчния хлороформ се използва окончателен процес на измиване с вода и метанол. Във втори етап тръбите след това се изрязват с помощта на CO2 лазер (Wild Emco Lasertec, Hallein, Австрия). Фиг. 3: вляво: водолазен робот, вдясно: CO2 лазер 21
25 Разфасовките са контролирани с ЦПУ. За фиксиране полимерните тръби се поставят върху керамичен дорник, който позволява на лазера да се движи напред, назад и в ротация. За да се гарантира, че материалът е напълно прорязан, всички режещи пътища се преминават два пъти. Крайният резултат са PLLA стентове с размер mm и диаметър на опората 270 m, които се завършват в последен етап чрез пръскане върху разтвор на PLLA Sirolimus в съотношение 70:30, покритието с лекарствен спрей. Фиг.4: Спрей покритие - пръскане на разтвора за покритие. Съставът на разтвора е резултат от предварителни тестове, които показаха, че сиролимусът се отделя само при концентрация от поне 20% [16]. Полученото покритие Pharmakon е около 1,5 g/mm 2. Докато стентът се използва, той се съхранява на сухо място при 20 ° С, за да удължи срока на годност. Тъй като стерилизацията е свързана с намаляване на вискоеластичните свойства [15, 16], това не се прави. Едноминутната дезинфекция на стента с етанол се извършва непосредствено преди имплантацията. 22-ри
31 Процесът на анастомоза се извършва изключително от един и същ хирург (C.M.B.) с помощта на призматична лупа с увеличение 2,5 пъти, за да се гарантира възможно най-голяма стандартизация на хирургичната техника. Фиг.6: Имплантиране на бифуркационна протеза aortobiiliakal; интраоперативен ситус. Имплантацията на стент е рандомизирана. Успоредно с подготовката за стента (3.1.), Проксималният (скоба на Сатински) и дисталният крайник (скоба на Булдог) на общата илиачна артерия се притискат върху животното, както и приблизително 0,5 cm дълъг, напречен разрез на затегнатия протезен крайник на разстояние 2 см близо до анастомозата. Двете страни на съда се промиват през разреза и се изплакват с физиологичен разтвор на хепарин. След предварително разтягане с Overholt, стентът, пресован върху балонен катетър 6/40 mm (PHERON, Biotronik, Берлин, Германия), се въвежда в средата на зоната на анастомозата и се разширява постепенно под визуален контрол. 28
32 Фиг. 7: Имплантиране на стента под визуален контрол. Стентът се разширява чрез надуване на балонния катетър до 8 бара. Както е описано по-горе, металният стент се разширява за секунди, докато разширяването на PLLA стента отнема 8 минути (1 bar/min). След повторно позициониране на катетъра, разреза, необходим за достъп, се затваря с конци с един бутон (Prolene 6.0 BV) и общата илиачна артерия се излага след отстраняване на булдога. Накрая се проверяват жизнените параметри на животното. 29
33 Фиг. 8: Надуване на илиачния анастомотичен стент, който се вижда макроскопски през съдовата стена. След като стентовете са успешно вкарани в съдовете, артериалният катетър се отстранява и аортата се затваря с Prolene. Това е последвано от интравенозно приложение на 1,5 g ампицилин/сулбактам (Unacid) и изплакване на корема с разтвор на NaCl гентамицин, както за антибактериална профилактика. След отстраняване на надпубисния пикочен катетър със затваряне с Z шев (Vicryl 3.0 SH) и преместване на чревните бримки, ретроперитонеумът се отваря непрекъснато с 3.0. Викрилов шев и перитонеумът се затварят с Mersilene. Подкожният шев също се прави с работещ 3.0. Викрилов шев, кожата се зашива с абсорбираща нишка след дезинфекция с разтвор на йодид. В допълнение, 40 mg еноксапарин (Clexane) и 5 ml от широкоспектърния антибиотик окситетрациклин (Terramycin, Pfitzer Animal Health, Exton, USA) се прилагат подкожно в седалищните мускули. 30-ти
35 се прилага веднъж сутрин и вечер. Прасето се транспортира обратно до дома за животни. Доплер сонография: Доплер сонографските изследвания на аортоилиачните съдове се извършват интраоперативно (след протези и след имплантиране на стент) и две и шест седмици след имплантацията. Максималният артериален кръвен поток на бедрената кост (Fmax, khz) се определя с помощта на техниката на непрекъсната вълна, за да се оценят свойствата на потока на дисталната анастомоза. Фигура 9: Доплер сонографско изследване на феморалния кръвен поток Компютърна томография: За да се определи проходимостта на стентовете с течение на времето, компютърни томографски изследвания с помощта на контрастно вещество (Tomoscan AV, Philips Германия; Aquileon TSX 101A, Toshiba, Германия) на аорто-илиачните съдове се извършват след един, два, четири и шест седмици, използвайки том 32
36 техника на рендиране (VRT), която позволява едновременно показване на повърхности и конструкции и проекция с максимална интензивност (MIP), специална обемна техника за визуализация. Животните са използвани за разследванията, както в 3.3. описан, успокоен. Фиг. 10: CT аорто-илиачна област. И двата стента са непрекъснати. Голяма стрелка: метален стент, счупена стрелка: PLLA стент (не рентгеноконтрастен) Вземане на проби и хистология: За да може да се оценят съдовите и периваскуларните секции в областта на стента от хистоморфологична и контурна гледна точка, секциите на съдовете, носещи стент, както и зоните на преход към протезата или към естествен кораб, експлантиран след период от 6 седмици. 33
38 Ниво 1: Ниво 2: Ниво 3: Проксимално на анастомозния стент и протеза Шевове на анастомоза Дистално място на стента и съда на анастомозата Пробите от съдове се изрязват с дебелина на слоя 10 m, оцветяват се в разтвор на хематоксилин/еозин (НЕ) и се изсушават. Хистопланимиметрия: За да може морфометрично да се оценят хистологичните разрези, те се снимат с цифрова система за микроскопи (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Хамбург, Германия) и се прехвърлят на компютър. Всички раздели са цифровизирани за контурни анализи и оценени със софтуера Image J (версия 1.32j) от уебсайта на националния здравен институт (. За да се оцени пост-интервенционната проходимост на съдовете, диаметърът на остатъчния лумен (RL, mm) в нива 1, 2 и 3 при шест измервания, базирани на неоинтималната граница от страната на лумена, определена под ъгъл от 60% и изчислена от средната аритметична стойност. Неоинтималната хиперплазия се определя от средната интимна дебелина (MID, mm), която е над подпорите на ниво 3 е измерена, определена 35
39 Хистоморфология: Хистоморфологичната оценка се извършва от двама независими проверяващи, които са заслепени от наличието на сиролимус в PLLA стентовете. Оценка на наранявания За да се оцени полуколичествено степента на увреждане на съдовата стена, причинено от стента, се изследват 4 последователни разреза дистално от анастомозата с помощта на светлинен микроскоп и се създава индекс на нараняване. Всяка отделна опора на секция се оценява и се присвояват числови резултати (0 3): 0 lamina elastica interna (LEI) непокътната, среда на туниката не е компресирана, няма нараняване 1 LEI е непокътната или леко разкъсана, среда е компресирана, не е разкъсана 2 LEI и туника, разкъсана, адвентиция непокътната 3 lamina elastica externa (LEE) перфорирана, адвентиция повредена или перфорирана. Всички резултати се сумират и разделят на броя на оценените подпори, за да се получи резултат за нараняване за целия стент [48]: Резултат от нараняване (IS) = сбор от всички резултати, брой оценени стойки 36
40 Възпалителен резултат Тази класификационна оценка се използва за записване на степента и плътността на възпалителната тъканна реакция след имплантиране на стент. За тази цел всеки отделен участък се изследва полуколичествено за появата на възпалителни клетки в четири последователни разреза дистално от анастомозата и се присвояват числени резултати (0 3): 0 няма възпалителни клетки 1 леко субинтално инфилтриране на лимфоцити и хистиоцити 2 локални умерени до плътни клетъчни агрегати 3 плътна инфилтрация на Лимфоцити и хистиоцити, обграждащи цялата опора. Възпалителният резултат за целия стент е резултат от сумата на отделните резултати, разделена на броя на оценените подпори [93]. IF = сбор от всички резултати, брой оценени подпори 3.8. Статистическа оценка: основните параметри на операцията и хистологичните данни са представени в средното отклонение +/- стандартно отклонение. Разликите се сравняват статистически, като се използва несдвоеният двустранен Т тест. Представянето на измерванията на доплер ултразвук, използвайки средно аритметично. Данните 37
44 Последваща доплер сонография: След имплантиране на протезата, непрекъснатата вълнова доплер сонография показва амплитудни намаления на систоличния кръвен поток, които се обръщат чрез имплантиране на стент. След шест седмици не е имало хемодинамично намаляване на феморалния кръвен поток в групата на PLLA стентове с метално и сиролимусно покритие. За разлика от това, има намаление на Fmax в групата на PLLA стентове. Компютърна томография: Всички стентирани групи имат отворен лумен на компютърна томография след 6 седмици. Непокритата група PLLA показва нередности, които показват стеноза. За разлика от това, в групата на Sirolimus PLLA може да се види почти необезпокояван артериален поток. Оценката на лумена след стентиране на метал е проблематична, тъй като металът произвежда артефакти в компютърна томография. 41
45 Фиг.11: CT аортоилна. И двата крака на протезата и AIC са отворени (десен метал, ляв PLLA). В областта на PLLA стента има нередности, които водят до умерено стесняване на лумена Хистологична оценка Всички сегменти, носещи стент, са непрекъснати, няма тромботична оклузия. Хистологичната оценка не показва данни за прекомерен откат или колапс на стент. Във всички екземпляри може да се намери непокътнат кръгов разрез. 42
46 Фиг. 12: Хистологичен разрез, показващ доказателства за отворени метални (*) и PLLA (**) стентове. Над опорите на стента (S) може да се види неоинтимална хиперплазия, която е по-изразена при PLLA. HE оцветяване, оригинално увеличение 12,5 x. Фиг. 13: Хистологичен разрез на стент SIR-PLLA. Има само минимална неоинтимална хиперплазия над опорите на стента (S). е. HE оцветяване, оригинално увеличение 12,5 x. 43
50 Хистологична оценка: всички стентирани сегменти показват отворен лумен, не е имало тромботична оклузия в тестовата серия. Хистологичната оценка разкрива непокътнат кръгов разрез на стент във всички сегменти, няма индикации за прекомерен откат или колапс на стент. Фиг. 17: Хистологичен разрез в областта на ACC, метал вляво, PLLA вдясно. Може да се види образуването на неоинтима над опорите на стента (S), което е по-изразено в PLLA. HE оцветяване, оригинално увеличение 12,5 x. 47