Делецията на Tbc1d1 потиска затлъстяването при мишки с дефицит на лептин - Международен вестник
субекти
абстрактно
Заден план:
Вариантите на гена TBC1D1 са замесени в признаци, свързани със затлъстяването, при няколко вида, включително хора, мишки, зайци и пилета. Докато вариантите на TBC1D1 са свързани със затлъстяването при хората, нарушаването на гена Tbc1d1 намалява телесното тегло при мишки. TBC1D1 е идентифициран като регулатор на инсулинозависимия транспорт на глюкоза в скелетните мускули, но ролята му в енергийната хомеостаза в затлъстяването остава неясна. Изследвано е влиянието на дефицит на TBC1D1 върху енергийната хомеостаза, метаболизма на глюкозата и липидите в установен миши модел за затлъстяване.
Методи:
Затлъстели лептин (ob/ob) и Tbc1d1 двойно дефицитни мишки (D1KO-ob/ob) са генерирани чрез кръстосване на наднормено тегло B6. V. Lep ob/ob мишки с слаби мишки с дефицит на Tbc1d1 на фон C57BL/6J. Мъжки мишки, получаващи или стандартна диета (SD), или диета с високо съдържание на мазнини (HFD), бяха изследвани за телесно тегло, телесен състав, прием на храна, доброволна физическа активност и разход на енергия чрез непряка калориметрия. Анализирани са толерантност към глюкоза и инсулин, както и транспорт на глюкоза и окисление на мастните киселини в скелетните мускули.
Резултати:
При затлъстели мишки дефицитът на Tbc1d1 доведе до намаляване на теглото на SD и HFD. Приемът на храна обаче остава непроменен при SD или дори се увеличава при HFD-хранени мишки с дефицит на Tbc1d1 без промяна в доброволната физическа активност. Въпреки значително намаления транспорт, стимулиран от инсулин, и повишеното окисление на мастните киселини в непокътнати изолирани скелетни мускули, мишките с дефицит на Tbc1d1 със затлъстяване не показват значителни промени в гликемията и глюкозния толеранс в сравнение с контролите на затлъстяването. Индиректната калориметрия показа, че затлъстелите мишки с дефицит на Tbc1d1 имат намален коефициент на дишане заедно с увеличен дневен разход на енергия.
Заключения:
При затлъстели мишки с дефицит на лептин дефицитът на TBC1D1 няма ефект върху поведението на хранене или енергийния прием, но води до увеличен разход на енергия, променено предпочитание на енергийния субстрат с повишено окисление на мастните киселини и потискане на затлъстяването. TBC1D1 може да играе еволюционно запазена роля в регулирането на енергийната хомеостаза при гръбначните животни.
Въведение
Материали и методи
материали
Човешки рекомбинантен инсулин (Actrapid HM Penfill) е закупен от Novo Nordisk Pharma GmbH, Майнц, Германия, а AICAR (аминоимидазол карбоксамид рибонуклеотид) е закупен от Enzo Life Sciences, Loerrach, Германия. Радиохимикалите са получени от Hartmann Analytic, Брауншвайг, Германия ([1- 14 C] -D-манитол, 0,1 mCi ml -1) и от American Radiolabeled Chemicals, Сейнт Луис, МО, САЩ ([9, 10 (n) - 3Н] палмитинова киселина, 1 mCi ml -1; 2- [1,2,3 Н (N)] дезокси-D-глюкоза, 1 mCi ml -1).
Поколение на затлъстели животни с дефицит на Tbc1d1
Генотипиране
Геномна ДНК от върховете на опашката на мишката беше изолирана с помощта на InViSorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Берлин, Германия). Мишките бяха генотипизирани за Tbc1d1 (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') и за успоредно (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').
Екстракция на РНК и синтез на cDNA
РНК се извлича от различни миши тъкани, използвайки QIAzol и RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия), съгласно указанията на производителя. CDNA е транскрибирана от 2 ug от общата РНК, използвайки GoScript обратна транскриптаза (Promega, Mannheim, Германия) и произволни хексамери P (dN) 6 (Roche, Mannheim, Germany).
Количествена PCR в реално време
Количествената PCR в реално време се извършва с помощта на сонди TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) за Tbc1d1 (Mm00497989_m1), PrlR (Mm00599957_m1) и за Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) . MWG, Ebersberg) като домакински ген. Анализите бяха проведени с PCR-системата за бързо реално време-7500 от Applied Biosystems (Приложни биосистеми). Данните бяха нормализирани съгласно метода ΔCt чрез изваждане на стойността на Ct на бета-актин от стойността на Ct на целевия ген. 16.
Анализ на телесното тегло, телесния състав и дължината на тялото
Общото телесно тегло беше анализирано с електронен баланс (Sartorius, Göttingen, Германия). Съставът на тялото (телесни мазнини и чиста маса) се определя с ядрено-магнитен резонансен спектрометър (Bruker-Minispec NMR анализатор mq10, Bruker Optics, Ettlingen, Германия). Дължината на тялото се анализира чрез измерване на дължината от носа до ануса.
Глюкоза, тестове за толерантност към инсулин
След гладуване през нощта животните получават орален глюкозен болус (2 g на kg телесно тегло, 20% разтвор) чрез сонда. Кръвни проби се взимат от върха на опашката по различно време (0, 15, 30, 60 и 120 минути) и нивата на глюкоза и инсулин се определят, както е описано по-долу. За теста за инсулинов толеранс, мишките са гладували цяла нощ и 2 IU инсулин на kg телесно тегло се инжектират интраперитонеално. Глюкозата в кръвта се определя 0, 15, 30 и 60 минути след инжектирането.
Параметри на кръвта
Кръвната захар се определя с глюкомер (Contour, Bayer, Leverkusen, Германия). Плазменият инсулин се измерва с ELISA (Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA, Alpco, Salem, MA, USA), плазмени кетонни тела с автомобилния комплект Total Ketone Bodies, свободни мазнини, киселини със системата NEFA-HR 2 (и двете Wako Chemicals, Neuss, Германия ). Адипонектинът беше анализиран с комплекта за мишка адипонектин ELISA (Millipore, Billerica, МА, САЩ), адипоцитокините IL-6, MCP-1, PAI-1 и резистин бяха анализирани с комплекта Milliplex MAP, миши серумен адипокин (Millipore) и IGF -1 със системата за разработка на DuoSet ELISA (R & D Systems, Abington, UK). Триглицеридите и свободният глицерин се определят със серумен комплект за определяне на триглицериди (Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия). Всички параметри на плазмата бяха определени, както е описано от производителя.
Анализ на усвояването на глюкоза и окисляването на мастни киселини в изолирани скелетни мускули
Мишките бяха анестезирани и мускулите на екстензора на пръстите и мускулите на задните крака бяха внимателно дисектирани. Инкубационната среда се състои от бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit, допълнен с 5 mM HEPES и 0,1% говежди серумен албумин без мастни киселини. Инкубацията се извършва на водна баня (30 ° С) с непрекъснато отделяне на газове (95% 02/5% СО2) и леко разбъркване. За да се определи усвояването на глюкозата, мускулите на екстензорния дигитурум longus се инкубират в продължение на 30 минути с 5 тМ глюкоза и 15 тМ манитол в отсъствие или в присъствие на 120 пМ инсулин. След окончателна инкубация с 1 mM [3 H] 2-дезокси-глюкоза (2.5 mCi ml -1) и 19 mM [14 C] манитол (0.7 mCi ml -1) в продължение на 20 минути, мускулите бяха незабавно в течен азот и лед, съхранявани замразени при -80 ° C. За да се определи скоростта на окисляване на мастните киселини, мускулите на солеуса се инкубират в бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit, съдържащ 5 mM глюкоза, 15 mM манитол, 3,5% без мастни киселини говежди серумен албумин, 4 mCi ml -1 [ 3Н] палмитат и 600 μM съдържат немаркиран палмитат със или без 2 mM AICAR при 30 ° C за 120 минути и радиоактивността се измерва чрез сцинтилационно броене на средата.
Непряка калориметрия
Дихателните коефициенти и анализите на ЕЕ са описани другаде. 7 Накратко, животните преминаха през фаза на адаптация от 24 часа преди измерването. Клетките бяха поставени в климатична камера при 22 ° C и потреблението на кислород (VO 2) и производството на въглероден диоксид (VCO 2) бяха наблюдавани в продължение на 23 часа при скорост на потока от
Храна-напитка
Приемът на храна и физическата активност се наблюдават с автоматизирана система за анализ на TSE (тип 302015-c/32, TSE Systems, Бад Хомбург, Германия). Животните имаха свободен достъп до фуражи и вода и сензорите за тегло на фуражните кошници регистрираха количеството фураж, консумирано от всяко животно. Физическата активност се определя с инфрачервени сензори.
Western blot анализ
Чернодробни триглицериди
Чернодробната тъкан се хомогенизира в 10 mM натриев фосфатен буфер с 1% полиоксиетилен-10-тридецилетан и 1 mM EDTA, като се използва тъканен лизер (Qiagen). Хомогенатът се инкубира за 5 минути при 70 ° С и се центрофугира за 10 минути при 16 000 rcf. Чернодробните триглицериди са измерени в супернатантата с комплекта (TRIGS) (Randox, Crumlin, UK), както е описано в ръководството.
Гликоген в тъканите
Тъканите се хомогенизират в 1 М КОН, инкубират се за 30 минути при 70 ° С и се неутрализират с концентрирана оцетна киселина. Добавя се амилоглюкозидаза (Sigma-Aldrich) и пробите се инкубират една нощ при 37 ° С. След центрофугиране (10 минути, 2000 rcf), глюкозата в супернатантата беше измерена с глюкозен ликвиколор (Human, Taunusstein, Германия) съгласно указанията на производителя.
Резултати
Делецията на Tbc1d1 води до значително намаляване на телесното тегло при затлъстели мишки
Телесно тегло и телесен състав на мишки WT и D1KO ob/ob. ( а ) Телесно тегло, ( б ) Обща маса на телесните мазнини и ( ° С ) Чиста телесна маса на мъжки WT и D1KO-ob/ob мишки, отглеждани или на SD, или на HFD. Данните представляват средно ± sem; n = 17-30 (SD) и n = 6-23 (HFD); * P -1 за 24 часа ± 0,054 kJ g -1 за ден) 24 часа; D1KO-ob/ob: 1,44 kJ g -1 за 24 часа ± 0,09 kJ g -1 за 24 часа). При хранене с HFD, количеството консумирана храна се увеличава значително при по-слабите D1KO-ob/ob мишки в сравнение с WT-ob/ob животните (WT-ob/ob: 1,32 kJ g -1 за 24 часа ± 0, 054 kJ) g -1 за 24 часа; D1KO-ob/ob: 1,63 kJ g -1 за 24 часа ± 0,087 kJ g -1 за 24 часа; P = 0, 00015). В допълнение, анализът на приема на храна при по-млади, 7-седмични мишки показва сходни резултати, без значителни разлики при SD-хранени животни и увеличена консумация на храна при HFD-хранени Tbc1d1-дефицитни мишки D1KO-ob/ob (допълнителна фигура 2г). .
Прием на храна и физическа активност на WT и D1KO-ob/ob мишки. ( а ) Тъканно разпределение на TBC1D1 при 16-седмични мъжки WT ob/ob мишки, анализирани чрез Western blot. ( б ) Експресия на Tbc1d1 в различни мозъчни региони на затлъстели WT и D1KO-ob/ob мишки, както и в слаби WT-ob/+ мишки и в скелетни мускули (M. quadriceps) на WT и D1KO-ob/ob мишки, които са носени бяха анализирани количествени PCR в реално време с бета-актин като домакински ген. Експресията на Tbc1d1 се нормализира до експресията на WT мишки в скелетните мускули. Мишките бяха на 16 седмици и хранеха SD; Данните представляват средно ± sem; п = 6-10. ( ° С ) Приемът на фураж, измерен за 24 часа, коригиран към общото телесно тегло и ( д Доброволна физическа активност, анализирана чрез инфрачервена светлина при 15-седмични мъжки мишки, отглеждани с SD или HFD. Данните представляват средно ± sem; п = 5-11; * P -1 ± 0,032 kJ g -1; D1KO- ob/ob: 2.78 kJ g -1 - 0.032 kJ g -1; P = 0,009) (Фигури 3в - г).
Гликемичен контрол на WT и D1KO-ob/ob мишки. ( а ) Глюкоза в кръвта на 17-седмични мъжки мишки в постпрандиално състояние на SD или HFD. ( б ) Кръвна глюкоза от 12-седмични мъжки мишки, хранени със SD, и ( ° С ) съответстващи плазмени нива на инсулин по време на перорален GTT с 2 g глюкоза на kg. ( д ) Кръвна глюкоза на мъжки мишки на възраст 14 седмици, отгледани на SD с 2 IU инсулин на kg по време на интраперитонеален инсулинов толеранс. Данните представляват средно ± sem; п = 5-9; * P 3H] 2-дезокси-глюкоза в скелетната мускулатура, анализирана, както е описано. Както е показано на ФИГ. 5а, и двете групи с дефицит на лептин показват намалено усвояване на глюкоза при инсулинова стимулация в сравнение с постно контролирани WT-ob/+ животни (WT-ob/ob: 4.63 nmol mg -1 за 20 минути ± 0.40 nmol mg -1 на ден) 20 минути; WT-ob/+: 6.09 nmol mg -1 за 20 минути ± 0.039 nmol mg -1 за 20 минути; P = 0,079). D1KO-ob/ob мишки обаче показват значително намалено поглъщане на глюкоза, стимулирано от инсулин, в сравнение с WT-ob/ob мишки (WT-ob/ob: 4.63 nmol mg -1 за 20 минути ± 0.40 nmol mg -1 за 20 минути; D1KO-ob/ob: 3,26 nmol mg –1 на 20 минути ± 0,19 nmol mg –1 на 20 минути; P = 0,0019).
Влиянието на повишеното окисление на мастните киселини върху развитието на телесното тегло обаче е противоречиво. В две независими проучвания с Acc2 -/- мишки се предполага, че по-голям приток на мастни киселини в митохондриите е достатъчен, за да увеличи ЕЕ и да намали телесното тегло. 21, 22 В едно от тези проучвания е показано, че Acc2 -/- мишките са намалили нивата на малонил-CoA и следователно са увеличили β-окислението в скелетните мускули. 21 Във второто проучване авторите наблюдават увеличаване на ЕЕ и намаляване на телесното тегло при мишки Acc2 -/- и стигат до заключението, че тези ефекти могат да бъдат пряко приписани на повишено снабдяване с мастни киселини и последващо увеличаване на окислението в митохондриите . 22 За разлика от това, скорошно проучване с Acc2 -/- мишки от Hoehn и колеги 23 не установи промени в ЕЕ или телесното тегло, което предполага, че повишеното β-окисление може да не е достатъчно, за да обясни ефекта на потискане на затлъстяването от Мишки с дефицит на лептин и Tbc1d1.
Затлъстяването корелира с намалена инсулинова чувствителност и обратно, може да се очаква, че намаляването на съдържанието на телесни мазнини води до повишаване на инсулиновата чувствителност. 24 Въпреки че мишките с дефицит на Tbc1d1 с D1KO-ob/ob с по-ниско общо съдържание на телесни мазнини от контролите бяха значително по-ниски, нивото на кръвната захар не беше понижено. В допълнение, нито глюкозният толеранс, нито инсулиновата чувствителност са били значително променени при тези мишки, което показва, че намаленото освобождаване на глюкоза в скелетните мускули на мишки с дефицит на Tbc1d1 D1KO-ob/ob компенсира благоприятния ефект на потискането на затлъстяването върху гликемията при тези мишки мога.
Мутациите в TBC1D1 също са свързани с контрола на телесното тегло при хората. Две проучвания показват връзка между кодиращия вариант R125W и индекса на телесна маса (ИТМ) при жени, податливи на затлъстяване, докато TBC1D1 единичните нуклеотидни полиморфизми при мъжете и жените от EPIC Потсдам установяват силна връзка с ИТМ и обиколката на талията стана кохорта. 10, 11, 25 Съответните проучвания върху животни при прасета, зайци и пилета разкриха връзка между вариантите на TBC1D1 и телесния състав и затлъстяването. 12, 13, 14, 15 Настоящото ни проучване при затлъстели мишки предполага, че TBC1D1 играе еволюционно запазена роля в регулирането на телесното тегло и състава на гръбначните животни. Молекулярната основа на това наблюдение и възможният еволюционен подбор на вариантите на TBC1D1 се нуждаят от допълнително проучване.