Автоматично секвениране (принцип), Практически аспекти на автоматичното секвениране -
Преходът към автоматично секвениране изисква, на първо място, електрофореза на всичките четири семейства ДНК сегменти в една писта. Както вече беше отбелязано, е трудно да се установи относителното положение на четирите ленти, разположени в различни коловози и различаващи се по дължина само от един нуклеотид. Логиката на визуалната оценка на ситуацията от човек може да внесе корекции в споменатата по-горе възможност за различия в условията на разделяне в различни коловози. Вероятно тази логика може да бъде „преподавана“ на компютър, но това значително ще усложни програмата му и надеждността му е трудно да се предвиди.
Междувременно и при двата метода преходът към електрофореза в една писта с помощта на радиоактивен етикет е невъзможен. Ще са необходими четири различни радиоактивни изотопа, за да се идентифицира значението на всяка лента. Да кажем, че ще бъде на разположение за биологични приложения ^^ 14. ° С, ^ S и 32 ?. Разликата между тези изотопи може да се прояви само в степента на почерняване на рентгеновия филм. Но, първо, енергията на p-радиацията на два от тези изотопи (^ C и ^ S) е почти еднаква и, второ, степента на почерняване ще зависи от още един, напълно неизвестен фактор - броя на ДНК сегментите, които са случайно еднакви по дължината и следователно обобщават тяхното излъчване в една лента. (Нека не забравяме, че първоначално за секвениране имаме не един, а много много идентични фрагменти на ДНК, независимо копирани при условията на случайни прекъсвания на този процес.)
Решение на проблема беше намерено чрез използване на флуоресценция вместо радиоактивност за идентифициране на ленти в гела. На базата на дихлородамин са разработени четири флуоресцентни багрила с различни цветове, с емисионни максимуми при 544, 569, 597 и 622 ts, разположени в зелената, жълто-зелена, оранжева и червена области на спектъра и лесно отделими в спектрофотометъра . Авторите успяват да свържат тези багрила с четири дидеоксирибонуклетида. По този начин, при лазерно облъчване на гела, всяка лента по метода на Сангер с електрофореза в една следа декларира своята специфичност със съответния радиационен цвят.
Разбира се, всяка лента в гела, поради своята крайна ширина и определена крива на разпределение на веществото по тази ширина, излъчва флуоресцентна светлина също под формата на определен звънчевиден пик на интензитета на светлината, разтегнат в посока на електрофореза. В долните си части тези пикове могат да се припокриват (както се припокриват от техните граници и съответните ленти в гела). Но върховете на върховете бяха добре разделени един от друг и това направи възможно да се определи серийният номер на всеки нуклеотид директно от тези върхове. А личността му е в цвета на върха.
Първият въпрос, който изисква изясняване, е какво да се направи със синтеза на праймер, ако началото на ДНК фрагмента, който ще се секвенира, е неизвестно. Отговорите могат да бъдат два. Първият (тривиален) е по някакъв друг начин да се определи първоначалната последователност на секвенираната ДНК. Второто е да прикачите друга кратка, но добре позната нуклеотидна последователност към тази ДНК, преди да започне, като се използва естествена връзка захар-фосфат. За да синтезирате праймер, като го използвате, засадете го върху него и по този начин принудете ДНК полимеразата да прочете шаблона, който ни интересува от първия нуклеотид. И двете решения на проблема могат да бъдат намерени във вече познатия ни материал:
1. Изясняване на началната последователност на секвенирания ДНК фрагмент
а) Ако за него не се знае нищо, тогава можете да използвате "остарелия" метод на Максим и Гилбърт, който за първите десетки нуклеотиди достатъчно бързо дава доста надеждна информация.
б) Ако се интересуваме от секвениране на специфичен ген, който насочва биосинтезата на много специфичен протеин с известна структура, и ако има основание да се смята, че този ген (или поне неговото начало) е част от изследвания ДНК фрагмент . Това означава, че началната последователност на дезоксирибонуклеотидите на съответния ген е със същата дължина. В този случай синтезираният праймер просто ще възпроизведе декодираната част от иРНК.
2. Прикрепване към началото на секвенирания фрагмент на известна ДНК последователност за синтеза на праймер върху него.
По същество вече извършихме тази операция, когато разгледахме възможността за вграждане на фрагменти от чужда ДНК с дължина хиляди нуклеотиди в плазмиди. Пълната нуклеотидна последователност за различни плазмиди (налични в търговската мрежа) е добре известна. По този начин можем естествено да свържем началото (и края) на секвенирания ДНК фрагмент с известната нуклеотидна последователност на плазмида.